用两相循环流系统实时成像和定量真菌生物膜的研究

这种方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，如流体流动如何改变真菌生物膜的生长和发展。该技术的主要优点是，它使我们能够定量地实时评估流对生物膜生长发育的影响。开始这个实验与流装置的组装，如文本协议中所述。

实验当天，连接气泡陷阱、温度探头和所有单次使用组件。要组装过滤器，请从一毫升注射器中拆下柱塞，使其成为适配器。将滤瓶中的管子强制到此端，将 2 微米过滤器连接到管材上，从而进入生长瓶。

在连接滑轨适配器之前，在滑轨适配器的棒子周围涂抹硅胶真空润滑脂，因为这样有助于防止空气泄漏到系统中。用 100 毫升 YPD 填充附瓶，用 200 毫升 YPD 填充生长烧瓶。确保绿色侧管到达每个烧瓶中的介质。

确保所有阀门都打开。将气泡疏水阀连接到真空，然后将泵连接到气泡疏水阀下游的绿色侧管。以每分钟 3.3 毫升的流量泵送液体，以完全填充绿色一面。

然后，分配和丢弃大约一到两毫升的介质，因为前几个毫升通常含有死细胞或随机碎片。在继续之前，确保油管的绿色面充满介质，且气泡陷阱下游没有气泡。用 YPD 填充通道滑轨和储液罐，注意不要引入气泡。

将幻灯片连接到流量装置。然后泵出更多的液体，在橙色一侧形成约5米的缓冲液。这是为了防止在回流时意外将空气困在幻灯片中。

现在，首先将气泡陷阱的入口和出口种植关闭，准备将流量装置运送到显微镜。然后将绿色和橙色侧附件瓶阀夹紧。确保脉动阻尼器和滤瓶的螺钉盖紧固，因为它们在自动增压过程中可能会松动。

断开泵与油管的连接，使运输更加方便。然后将所有组件（包括热板搅拌器）移动到显微镜附近的辅助容器中。将温度探头连接到热板搅拌器，并开始将附件烧瓶加热至 37 摄氏度。

以 300 RPM 搅拌介质，并在整个实验中保持此速度。将幻灯片安装在显微镜上，必要时使用胶带将其固定。然后将气泡陷阱连接到真空中。

现在，将泵连接到流量装置。以每分钟 3.3 毫升的流量启动泵，并允许其运行约 5 到 10 秒。然后，在让出盖氏族中去除气泡陷阱。

当附件烧瓶加热时，让泵继续运转。一旦附体烧瓶和孵化室均在37摄氏度，将足够的真菌细胞过夜培养到附体烧瓶中，达到每毫升100万个细胞。等待 15 分钟，让细胞适应。

打开绿色和橙色侧附件烧瓶阀，同时关闭两个生长烧瓶阀，以启动细胞的流动。等待大约五分钟，让单元格到达幻灯片。在此期间，对焦显微镜并调整到之前实验中使用的相同成像参数。

开始附件阶段的图像采集。大约 5 分钟和 10 分钟后回来检查，确保保持焦点。如果没有，请尝试在获取下一个图像后立即调整焦点。

附件阶段结束后，立即保存文件。然后打开绿色和橙色侧增长烧瓶阀，同时关闭两个附件烧瓶阀。如果孵化室内有任何阀门，注意不要颠簸。

拔下温度计探头，用生长瓶更换附件烧瓶。现在，将软件配置为在 22 小时内每 15 分钟获取一次图像，并开始为生长阶段采集图像。一旦生长阶段采集完成并保存文件，打开绿色和橙色侧附件烧瓶阀，当橙色侧的压力释放时，可能会发出噪音。

从两个介质烧瓶中拉上绿色侧管，直到它们至少比介质高出几厘米。然后，以高速运行泵，从油管中卸下所有介质，从而更容易进行清洁。最后，量化文本协议中描述的视频。

这个时间推移的暗场显微镜视频显示野生型念珠菌细胞在附着阶段附着在基底，随后在生长阶段的生长发育，导致生物膜形成。这些视频的数据可以分析细胞附着率和分离率以及生物量，此处显示的是密度测定分析确定的成像区域内的总生物量。同时显示细胞附着的累积速率和生物量分离的百分比。

在尝试此过程时，必须记住在所有实验中使用相同的成像条件，因为这样可以进行定量比较。