Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как, как поток жидкости изменяет рост и развитие грибковой биопленки. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет количественно оценить влияние потока на рост и развитие биопленки в режиме реального времени. Начните этот эксперимент со сборки аппарата потока, как описано в текстовом протоколе.
В день эксперимента, приложите пузырь ловушку, температурный зонд, и все одноразовые компоненты. Чтобы собрать фильтр, удалите поршень из одного миллилитрового шприца, чтобы сделать его адаптером. Принупить трубки от бутылки фильтра в этот конец и прикрепить 2 микрон фильтр для труб, ведущих к росту колбы.
Нанесите силиконовую вакуумную смазку вокруг колючки адаптера слайда перед его подключением, так как это помогает предотвратить утечки воздуха в систему. Заполните колбу крепления 100 миллилитров YPD и заполните колбу роста 200 миллилитров YPD. Убедитесь, что зеленая сторона трубки достигает средств массовой информации в каждой колбе.
Убедитесь, что все клапаны открыты. Прикрепите пузырь ловушку к вакууму, и подключить насос к зеленой стороне труб вниз по течению от пузыря ловушку. Насос жидкости со скоростью потока 3,3 миллилитров в минуту, чтобы полностью заполнить зеленую сторону.
Затем, обойтись и отказаться примерно от одного до двух миллилитров средств массовой информации, потому что первые пару миллилитров часто содержат мертвые клетки или случайных мусора. Убедитесь, что зеленая сторона трубки заполнена средствами массовой информации и не имеет пузырьков вниз по течению от ловушки пузыря, прежде чем приступить. Заполните слайд канала и резервуар с YPD, заботясь, чтобы не вводить пузыри.
Подключите слайд к аппарату потока. Затем насос больше жидкости, чтобы создать буфер около 5 метров на оранжевой стороне. Это делается для предотвращения случайного захвата воздуха в слайде в случае обратного потока.
Теперь подготовь аппарат потока для транспортировки к микроскопу, сначала посадив вход и выход из пузырьовой ловушки закрытым. Затем зажим зеленый и оранжевый боковой крепления клапанов колбы закрыты. Убедитесь, что винт колпачки для пульсации демпфер и фильтр бутылки плотно, так как они могут ослабить во время автоматического покрытия.
Отключите насос от труб, чтобы облегчить транспортировку. Затем переместим все компоненты, включая мешалка горячей пластины, во вторичный контейнер рядом с микроскопом. Прикрепите температурный зонд к мешалке горячей пластины и начните нагревать колбу крепления до 37 градусов по Цельсию.
Перемешать средства массовой информации на 300 об /мин, и поддерживать это в течение всего эксперимента. Намонтировать слайд на микроскоп, и использовать ленту, если это необходимо, чтобы плотно закрепить его. Затем прикрепите пузырьковую ловушку к вакууму.
Теперь подключите насос к аппарату потока. Запустите насос со скоростью потока 3,3 миллилитров в минуту, и позволить ему работать в течение примерно 5 до 10 секунд. Затем удалите пузырь ловушку в пусть из крышки клана.
Разрешить насос продолжать работать в то время как вложения колбу нагревается. После того, как вложения колбы и инкубационой камеры оба на 37 градусов по Цельсию, добавить достаточно ночь культуры грибковых клеток в колбу крепления, чтобы достичь одного миллиона клеток на миллилитр. Подождите 15 минут, чтобы клетки акклиматизировались.
Откройте как зеленый, так и оранжевый боковые клапаны колбы при закрытии обоих клапанов колбы роста, чтобы начать поток клеток. Подождите около пяти минут, чтобы позволить ячейкам достичь слайда. За это время сосредоточьте микроскоп и отрегулируйте его под те же параметры изображения, которые использовались в предыдущих экспериментах.
Начните сбор изображений для фазы вложения. Проверьте обратно примерно через пять и 10 минут, чтобы убедиться, что фокус был сохранен. Если нет, попытайтесь настроить фокус сразу после получения следующего изображения.
Сразу же после завершения фазы вложения сохраните файл. Затем откройте как зеленый, так и оранжевый боковые клапаны колбы при закрытии обоих клапанов колбы крепления. Позаботьтесь, чтобы не ударить этапе, если какие-либо клапаны находятся внутри инкубационой камеры.
Отключите зонд термометра и замените колбу крепления колбой роста. Теперь настройте программное обеспечение, чтобы получить изображение каждые 15 минут в течение 22 часов, и начать получение изображения для фазы роста. После завершения приобретения фазы роста и сохранения файла откройте зеленые и оранжевые боковые клапаны колбы, которые могут шуметь по мере того, как давление высвобождается на оранжевой стороне.
Потяните вверх на зеленой стороне трубки исходя из обоих медиа колбы, пока они не по крайней мере несколько сантиметров над средствами массовой информации. Затем запустите насос на высокой скорости, чтобы удалить все средства массовой информации из труб, что делает очистку гораздо проще. Наконец, количественная оценка видео, как описано в текстовом протоколе.
На этом промежутке времени темное поле микроскопии видео показывает присоединение диких клеток типа Candida albican к субстрату подпоток во время фазы крепления, а затем последующего роста и развития в фазе роста, ведущей к формированию биопленки. Данные из этих видео могут быть проанализированы на скорость крепления клеток и отслоения и биомассы с течением времени, показано здесь общая биомасса в области изображения, как это определено анализом денситометрии. Также показана кумулятивная скорость крепления клеток и процентное отделение биомассы с течением времени.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать те же условия изображения во всех экспериментах, так как это позволяет количественные сравнения, которые будут сделаны между ними.
