板基检测血液中一氧化氮的 vasp 磷酸化

该协议解决了血小板在体外和体内作为高度敏感的一氧化氮传感器的潜在用途。增加磷酸化硫化物-刺激磷蛋白或P-VASP丝氨酸239在血小板一氧化氮有一些优点，包括能够检测一氧化氮在纳米摩尔血统的存在。在从健康献血者那里收集30至50毫升全血的两个小时内，将血液中的5毫升等同加入适当数量的15毫升锥形管中进行离心。

使用塑料转移移液器从超钠的上部仔细收集富含血小板的血浆。用第二个离心进行洗涤，将富含血浆的血小板切开，并在五毫升的 CGS 缓冲液中轻轻清洗颗粒。在室温下以400克离心10分钟。

在离心结束时，将颗粒重新用三毫升的改性泰洛德缓冲液中重新填充。使用血细胞计计算血小板悬浮液的密度，并在新鲜泰洛德缓冲液中将每毫升的血小板悬浮液密度调整为每毫升的 8 个细胞。然后在37摄氏度下孵育血小板悬浮液一小时。

同时，通过离心从整个血液样本的无板血浆层中收集红血球，然后每次洗涤用五毫升PBS进行四次洗涤。最后一次洗涤后，丢弃超级天然液，将红血球与富含血浆的血小板混合在用橡胶塞闭合的聚丙烯瓶中适当的实验性造血球中。将连接到氦气罐的针头插入每个隔膜，并插入 26 个测量针以制造气体出口。

然后在室温下缓慢旋转瓶子，并使用血氧计测量部分氧气压力，以监测脱氧过程。氧减少速率取决于氦流速和搅拌速度。因此，在开始实验之前，应优化氧合时间，因为这与实验设置的几何形状高度相关。

为减少红血球亚硝酸盐，使用微西林格通过隔膜将亚硝酸盐注射到PRP和RBC的脱氧样品中，以便达到10微摩尔最终浓度。在37摄氏度下孵育样品至少10分钟，将每个样品的1毫升转移到微离心管中进行离心。将300微升血小板悬浮液从超盐液的上部转移到新的微离心管中，并在每管中以1比9的比例加入柠檬酸葡萄糖。

再次离心血小板，将含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的80微升冰粒重新装给每管。接下来，将每个样品中15微克的蛋白质加载到两个独立的10%SDS-PAGE凝胶中。以 120 伏电压运行凝胶 1.3 小时。

在运行结束时，将凝胶转移到单个亚硝基纤维素膜中，并用适当体积的 5% 脱脂干牛奶阻断任何非特异性结合。在4摄氏度下用适当的原抗体孵育膜过夜，然后用适当的二级马萝卜过氧化物酶抗体在室温下孵育45分钟。然后用成像器曝光膜，使用适当的图像分析程序量化波段密度。

健康的静脉血样具有50至80毫米汞的部分氧压值。氦气的脱氧在10分钟内迅速将氧气的部分压力降低至25毫米汞。随着脱氧时间的增加，可以进一步降低部分氧压。

脱氧率的增加导致血解水平增加，日益红颜色的血浆表明这一点。这是脱氧效果，不是由搅拌本身引起的，如在没有氦气搅拌的样品中缺乏血解所示。如西方印迹所检测到的脱氧样品中，Vasodilator-刺激磷蛋白或VASP和磷酸化-VASP表达水平均随着脱氧样品中血红素的增加而降低。

使用短寿命一氧化氮供体进行治疗，在治疗后10秒内增加血小板中的磷酸化血管扩张剂刺激磷蛋白表达。此外，磷酸化-VASP或P-VASP水平在NO供体孵育后10分钟内保持稳定，其血小板丰富的血浆表明，有足够的时间将RBC与血小板分离，而不影响现有的P-VASP水平。在脱氧性 RBC 的情况下，亚硝酸盐还可提高血小板的 P-VASP 水平。

在这里，P-VASP与总VASP的比率取决于血红蛋白水平。VASP在血小板中表达强烈，在存在一氧化氮时迅速磷酸化。因此，本方案为研究各种生理刺激对一氧化氮的诱导提供了一种方法。

通过这种方法，我们成功地在血小板中使用增加的P-VASP作为体内吸入亚硝酸盐刺激的标记。不要忘记，使用带生物标本的血小板应始终使用适当的个人防护设备进行。