在 vivosilk/aav 薄膜在光基因表达中的靶向表达

这种方法可以帮助回答系统神经科学领域的关键问题。例如神经元合奏的活动如何支持大脑中的感官和认知处理。该技术的主要优点是，它便于将像Chan rhodopsin和GCaMP这样的光遗传学蛋白准确定位到感兴趣的大脑区域，而无需单独的病毒注射程序。

这种方法的视觉演示至关重要，因为将丝绸和病毒沉积到小型光学植入物中，需要一些实践才能达到可重复的结果。首先，混合解冻AAV和5%至7点5%水丝纤维素在200微升PCR管的一比一的比例。轻轻移液溶液多次，以彻底混合 AAV 和纤维素。

要沉积丝/AAV，请用纤维植入所需的溶液量装载注射移液器，外加大约 30%的额外溶液，以容纳移液器堵塞造成的损失。接下来，将铁杉支架安装到配备微电子化器的立体技术装置中。将铁杉支架放在微反应器上方，然后从下方涂抹丝绸/AAV 混合物。

操纵喷射移液器，直到接触或接近光纤表面的中心，并弹出 10 到 20 纳米的丝/AAV 溶液。然后，取取移液器。接下来，观察平坦表面上的丝绸/AAV的波卢斯，该花样显示为液体圆顶，在大约一分钟内干燥到平面膜。

重复前面的步骤，直到沉积所需的丝绸/AAV量。在准备多个植入物时，将丝/AAV 溶液应用于一个植入物，然后继续涂覆其他植入物，然后再返回第一个植入物。干燥一小时后，将整个铁杉架放入真空室中，并在大约 125 摄氏度和 4 摄氏度的温度下通宵进行真空干燥。

第二天，在高功率显微镜下评估所得丝膜的形状和位置。确保薄膜局限于光纤表面的尖端，相对薄且对称。对于锥形光纤的涂层，将丝/AAV 喷射移液器放在锥形开头的光纤侧面，确保移液器接触光纤。

喷射 20 纳米光的丝绸/AAV 以启动涂层过程，确保液滴粘附在光纤上，并保留在光纤和移液器的接口端。当丝绸/AAV 干燥时，轻轻将液滴对角，使注射移液器与干燥液滴保持接触，以避免堵塞移液器尖端。当第一个螺栓几乎完全干燥时，喷射出另外20纳米灯，然后沿着锥度继续吸水滴。

通过弹出少量丝绸/AAV，重复上一步，并在锥度一侧逐渐干燥溶液。干燥后，在高功率显微镜下评估所得丝膜的形状和位置。对于 GRIN 镜头植入物的涂层，将丝绸/AAV 沉积在 GRIN 镜头植入物上的单个喷射中。

干燥后，在高功率显微镜下评估所得丝膜的形状和位置，以确保薄膜覆盖透镜表面。对于镀膜玻璃颅窗，用手将五微升的丝绸/AAV液滴放在三毫米圆形盖滑的表面上，使液滴扩散到覆盖整个玻璃表面。干燥后，将丝绸/AAV涂层的光纤存放在冷却的真空干燥器中，温度为 125 托和 4 摄氏度，然后植入设备。

荧光标记光遗传学蛋白的荧光图像提供了丝绸/AAV薄膜表达程度的测量，典型的光纤可以方便地容纳200纳米的丝绸/AAV。通过实践，实验者可以在植入纤维的尖端实现高度可靠的表达。涂层颅窗的两个可能问题是表达不足，丝绸薄膜不能溶解，模糊了视野。

为了增加表达，可以在植入窗户之前进行子宫切除术，和/或增加薄膜中的病毒量。最佳表达是分别使用一至四种丝绸和库存的 AAV 混合物实现的。涂层窗户中的丝绸数量是纤维植入物的10至100倍，薄膜嵌入组织中较少，因此不能暴露在可溶解丝膜的相同水平的蛋白溶解活性中。

然而，一些丝绸的存在对于在窗户下实现你的表达至关重要，可能是因为单靠病毒制作的薄膜在手术过程中被间质液冲走。在尝试此过程时，以我们描述的方式准备和存储丝质涂层植入物非常重要。不当储存可能会改变丝膜的特性，或降低病毒表达载体的疗效。

这项技术对于系统神经科学领域的研究人员来说，对于探索神经活动如何驱动哺乳动物大脑（如小鼠、老鼠，甚至非人类灵长类动物）的感官和认知处理具有极大的效用。不要忘记，使用病毒表达载体可能是危险的，个人防护设备，如手套、护目镜和实验室外套，在使用腺相关病毒时应始终佩戴。