שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח של מערכות. כגון כיצד הפעילות של הרכבים עצביים תומכת בעיבוד חושי וקוגניטיבי במוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על מיקוד מדויק של חלבונים אופטוגנטיים כמו צ'אן רודופסין ו- GCaMP לאזורי עניין במוח, ללא צורך בהליך הזרקת וירוס נפרד.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו התצהיר של משי ווירוס שתלים אופטיים קטנים יכול לקחת קצת תרגול על מנת להשיג תוצאות לשחזור. ראשית, מערבבים AAV מופשר וחמש עד שבע נקודות חמישה אחוזים פיברוין משי מים ביחס של אחד לאחד בצינור PCR 200 מיקרוליטר. בעדינות pipette הפתרון פנימה ובחוץ מספר פעמים כדי לערבב ביסודיות את AAV ו fibroin.
כדי להפקיד את המשי / AAV, לטעון פיפטה הזרקה עם כמות הפתרון הנדרש עבור מספר שתלים סיבים שנעשו, בתוספת כ 30 אחוזים נוספים כדי להכיל הפסדים עקב סתימת פיפטה. לאחר מכן, הר מחזיק ferrule לתוך מנגנון סטריאוטוקסי מצויד microinjector. מניחים את מחזיק ferrule מעל microinjector ולהחיל את תערובת משי / AAV מלמטה.
לתמרן את פיפטה ההזרקה עד שהוא נוגע או כמעט נוגע במרכז פני השטח סיב אופטי, ולפלט 10 עד 20 nanoliters של פתרון משי / AAV. לאחר מכן, למשוך את פיפטה. לאחר מכן, להתבונן בולוס של משי / AAV על פני השטח השטוחים אשר מופיע כמו כיפה נוזלית כי מתייבש לסרט שטוח בתוך כדקה אחת.
חזרו על השלבים הקודמים עד להפקדת הכמות הרצויה של משי/AAV. בעת הכנת שתלים מרובים, להחיל את פתרון משי / AAV על שתל אחד ולאחר מכן לעבור מעיל שתלים אחרים, לפני החזרה הראשון. לאחר שעה אחת של ייבוש, מניחים את כל מחזיק ferrule לתוך תא ואקום ואקום להתייבש לילה בערך 125 טור וארבע מעלות צלזיוס.
ביום שלמחר, להעריך את הצורה והמיקום של סרט המשי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ בה עוצמה גבוהה. ודא שהסרטים מוגבלים לקצה משטח הסיב האופטי, דק יחסית וסימטרי. לציפוי סיבים אופטיים מחודדים, מקם את פיפט הזרקת המשי/AAV בצד הסיב האופטי בתחילת ההתחדדות, וודא שהפיגט נוגע בסיבים האופטיים.
להוציא 20 nanoliters של משי / AAV כדי להתחיל את תהליך הציפוי, להבטיח כי טיפה דבק סיבים אופטיים ונשאר בממשק של סיבים פיפטה. בעדינות פתיל את הטיפה לקראת סוף קצה הסיבים כמו משי / AAV מתייבש, ולשמור על פיפטה הזרקה במגע עם טיפת ייבוש, כדי למנוע סתימת קצה פיפטה. כאשר הבולוס הראשון התייבש כמעט לחלוטין, להוציא עוד 20 nanoliters ולהמשיך פתיל את טיפה לאורך ההתחדדות.
חזור על השלב הקודם על ידי הוצאת כמויות קטנות של משי / AAV, ובהדרגה ייבוש הפתרון במעלה הצד של ההתחדדות. לאחר הייבוש, להעריך את הצורה והמיקום של סרט משי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ בה עוצמה גבוהה. לציפוי שתלי עדשת GRIN, יש להפקיד משי/AAV בזריקה אחת על שתל עדשת GRIN.
לאחר הייבוש, להעריך את הצורה והמיקום של סרט המשי וכתוצאה מכך תחת מיקרוסקופ כוח גבוה כדי להבטיח כי הסרט מכסה את פני השטח של העדשה. עבור ציפוי חלונות גולגולתיים מזכוכית, יד פיפטה טיפה חמישה מיקרוליטר של משי / AAV על פני השטח של כיסוי עגול שלושה מילימטר להחליק, כך טיפה מתפשטת כדי לכסות את משטח הזכוכית כולו. לאחר הייבוש, יש לאחסן את הסיבים האופטיים מצופים המשי/AAV במייבש ואקום מקורר ב-125 מעלות וארבע מעלות לפני השתלת המכשירים.
תמונות פלואורסצנטיות של חלבונים אופטוגנטיים המתויגים על ידי פלואורופור סיפקו מדד להיקף הביטוי של סרטי המשי/AAV, וסיבים אופטיים טיפוסיים יכולים להכיל בקלות 200 ננוליטר של משי/AAV. עם תרגול, ניסויים יכולים להשיג ביטוי אמין מאוד סביב קצה סיבים מושתלים. שתי בעיות אפשריות עם חלונות גולגולתיים מצופים אינן מספיקות, וסרטי משי שאינם מתמוססים ומטשטשים את שדה המבט.
כדי להגביר את הביטוי, ניתן לבצע כריתת דורה לפני השתלת החלון, ו/או הגדלת כמות הנגיף בסרט. הביטוי הטוב ביותר הושג באמצעות תערובת אחת עד ארבע של משי ו- AAV טיטר מניות, בהתאמה. כמות המשי בחלונות מצופים גדולה פי 10 עד 100 מאשר על שתלי סיבים, והסרט מוטמע פחות ברקמה, ולכן ייתכן שלא ייחשף לאותן רמות של פעילות פרוטאו-אוליטית שיכולה להמיס סרטי משי.
עם זאת, נוכחות של משי כלשהו חיוני להשגת הביטוי שלך מתחת לחלונות, ככל הנראה בגלל סרט עשוי וירוס לבד נשטף על ידי נוזל interstitial במהלך הניתוח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להכין ולאחסן שתלים מצופים משי באופן שאנו מתארים. אחסון לא תקין עשוי לשנות את המאפיינים של סרטי משי, או להקטין את היעילות של וקטורים ביטוי ויראלי.
טכניקה זו יכולה להיות תועלת רבה עבור חוקרים בתחום מדעי המוח של מערכות כדי לחקור כיצד פעילות עצבית מניעה עיבוד חושי וקוגניטיבי במוחם של יונקים כגון עכברים, חולדות, או אפילו פרימטים לא אנושיים. אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ביטוי ויראלי יכול להיות מסוכן וציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוקי מעבדה, תמיד צריך להיות משוחק תוך כדי עבודה עם וירוס הקשורים אדנו.
