要充分描述微胶质表型，必须同时解决基础和定向运动问题。该协议可用于利用定制的3D打印界面和灌注室，在小鼠脑片中通过双光子成像来测试微胶质的方向性。展示这个程序的将是范妮·艾蒂安，一个博士生，和文森佐·马斯特里奥利亚，一个博士后研究员，都来自我们的实验室。
解剖前至少30分钟，开始在冰上冒泡70毫升胆碱人工脑脊液，或胆碱ACSF。在32摄氏度下加入150毫升胆碱ACSF，加入碳原。将一个200毫升的结晶盘与棒磁铁放入密封的食物盒，并在菜中加入200毫升的ACSF。
将 3D 打印界面切片架放在盘上，从结晶盘中去除多余的液体，直到仅保留覆盖界面滑动架网格的薄膜溶液。在食品盒底部加入几毫米的 aCSF，然后开始用碳原冒泡液体。然后，关闭密封盒，同时保持恒定的碳化物，形成一个加湿的、95%的氧气、5%富含二氧化碳的界面室。
收获后，将大脑放在一块CSF浸泡的滤纸上，根据切片的首选角度解剖出感兴趣的区域。对于日冕切片，将大脑的冠状面固定到连接到振动切片器切割块上的 10 厘米 Petri 盘上，并在充满冰的大腔室中将块放在振动切片器的储层室中。用冰冷的胆管 aCSF 填充盘子，并使用切片器获得 300 微米厚的脑片，使用直径四毫米直径的一次性转移移液器在刀片的每一次通过后收集每片。
让每片在32摄氏度的胆碱ACSF中恢复约10分钟后，它得到，然后转移片片到片片清洁纸，并加一滴胆碱ACSF。然后吸出多余的胆碱ACSF，并使用铲将切片转移到接口室的网格上，使切片在此环境中恢复至少30分钟。开始录音前 30 分钟，将活体泵连接到具有顶部和底部灌注的定制记录室，以优化组织切片的氧合和生存能力，并用 50 毫升超纯水清洁整个灌注系统。
在清洁周期结束时，在不断的碳化下，在玻璃烧杯中用 50 毫升 aCSF 开始灌注记录室，并使用一次性宽口移液器将第一片片转移到烧杯上以取出透镜纸。当截面沉入烧杯底部时，将截面转移到记录室，并将切片架放在切片上，以最大限度地减少灌注流量引起的运动。使用亮场照明以 5 到 10 倍的放大倍率定位感兴趣的大脑区域。
然后，使用 25 倍目标与 0.35 倍水浸透镜调整观察场的位置。使用荧光照明定位荧光微胶质细胞，并在移液器上回填10微升的ACSF，其中含有最终浓度时感兴趣的化合物。用柔和的摇动向下点尖，以去除夹在尖端中的任何气泡，将填充的移液器安装到连接到五毫升注射器的移液器支架上，柱塞位于五毫升位置，并安装在三轴微操纵器上。
轻轻地向切片下部移液器，同时控制和调整目标，直到移液器尖端轻轻接触切片表面。现在调谐激光并切换到多光子模式。确保室从任何光源中筛选出来，然后打开非扫描式探测器。
设置增益并使用具有颜色编码上限的查找表，以避免使图像中的像素饱和。然后，开始记录，总持续时间至少30分钟，慢慢地将注射器柱塞从5毫升位置压到1毫升，5分钟后，在5秒内，将化合物应用到该部分。对于图像分析，首先在感兴趣的文件上使用 ImageJ 执行 z 投影和漂移校正。
然后，打开"冰"中修改的文件，绘制一个圆形的、直径为 35 微米的感兴趣区域，以注射部位为中心。使用 ROI 再次运行影片，以确保影片处于有利位置。然后，使用兴趣强度演化插件区域测量感兴趣区域中一段时间的均度强度，并保存结果为 xls 文件。
该协议允许测量不同化合物（如ATP或血清素）引起的反应。虽然 ATP 的注射会导致荧光增加，但大多数 ATP 注射后，由于几分钟后恢复的组织变形，荧光会立即略有减少。感兴趣区域的大小也会影响定量，因为增加直径会降低实验之间的变异性，但会降低检测到的响应的准确性和幅度。
评估特定时间点的微胶质反应可用于对不同化合物的统计比较，或测试添加到灌注溶液中的特定拮抗剂的效果。要在三维中量化活动性，请了解您可能需要更改 z 步长间隔和采集采样率，以符合分析要求。
