小鼠视网膜的经瞳双光子体内成像

这种视网膜细胞体内成像的方法可以调查眼科疾病并了解视网膜的正常功能。该方法提供了一种直接且高度可重复的双光子显微镜对视网膜进行体内成像的方法。正确稳定鼠标是获得高质量体内图像的关键。

练习将鼠标放在头架中，并在尝试获取图像之前熟悉该过程。根据批准的动物使用方案使动物镇静。应用瞳孔散大溶液，将鼠标放在黑暗中五分钟，让瞳孔扩张。

将下耳道销固定在向内伸展位置，将上耳道销固定在缩出位置。旋转头架的主臂，直到听筒杆倾斜到水平以下 60 度角。当鼠标面向咬杆时，将一只耳朵安装到伸出的下销上，并将销插入耳道。

松开固定上耳道销的螺钉后，将引脚伸入另一个耳道，然后重新拧紧螺钉以固定头部。确保鼠标固定在头架中。按下头顶。

鼠标应牢固地留在耳杆上，其头部应围绕耳道轴线自由旋转。将咬杆朝向小鼠头部，轻轻抬高鼠标头部，使上颌门牙降低到咬杆支架中，并用力轻轻缩回咬杆以固定头部。使用螺钉将咬杆固定到位，然后将鼠标和支架放在显微镜载物台上。

将润滑剂眼药水涂抹在鼠标的双眼上。旋转头架的主臂，直到一只眼睛的瞳孔与光路对齐，然后将数字 1.5 盖玻片放入紧凑型过滤器支架中。将支架固定到显微镜载物台后，降低盖玻片，直到它接触润滑剂眼部凝胶而不接触角膜，并在X-Y维度和物镜Z位置调整载物台，直到宽场激发光完全覆盖角膜。

使用目镜继续调整Z位置，直到视网膜中的荧光细胞或结构聚焦，根据需要增加落射荧光照明器以解析感兴趣的单个细胞或结构。微调视网膜与成像光路的对齐。调整头部角度，直到更改焦平面时仅发生失焦光的扩展或收缩，从而最大限度地减少 X-Y 变形。

然后，关闭落射荧光照明器，并关闭照明器快门。对于双光子成像，请遵循所有机构的激光安全协议。关闭并覆盖所有环境光，并将激发光路切换到激光器，将发射光路切换到光电倍增管。

在图像采集软件中，将帧大小设置为 512 x 512，将帧平均值设置为 3。将 Z 步进设置为从堆栈顶部开始并向下推进，最大限度地减少光感受器的双光子激光激活。打开并启用 PMT，并将电压调节到 680 伏。

启用成像和发射快门。从 1% 的激光功率开始对目标组织进行实时图像预览，并自动调整显示亮度以可视化感兴趣的细胞或结构。如果目标组织暗淡或不清楚，请增加激光功率百分比，直到结构变得可见且不超过 45 毫瓦。

在X-Y方向上操纵显微镜载物台以所需的成像区域为中心，并导航到聚焦感兴趣结构的Z平面。对于慢性延时实验，打开先前获得的图像以用作感兴趣细胞的参考，注意当前图像中的成像角度与先前图像的成像角度相似。然后，导航到感兴趣的上层和下部 Z 平面，以设置成像堆栈的 Z 极限并获取图像。

采集完所有图像后，禁用PMT和激光快门。将激发光路切换为落射荧光照明，并将发射光路切换回目镜。然后，退出图像采集软件，关闭计算机界面中的激光器，并按反向启动顺序关闭硬件，但始终在线的设备除外。

分析结束时，将鼠标从头架上取下，然后使用无绒纸巾轻轻取出眼部凝胶。然后，在双眼上涂抹润滑眼膏，并将鼠标放在 37 摄氏度的温水循环加热垫上，监测直到完全卧位，然后将鼠标放回其外壳。在VGlut-2-Cr小鼠中，视网膜神经节细胞体清晰可辨，轴突束通常很明显。

轴突的轨迹和脉管系统的负像有助于识别VGlut-2-Cre小鼠的视神经头，这是慢性成像实验中有用的标志。与视网膜神经节细胞相比，无细胞神经突更常在内丛状层中观察到。眼内NMDA注射一天后，视网膜小胶质细胞显示出短过程或变形虫形态，符合以前的报告。

在成像前 30 至 60 分钟通过单次腹膜内注射递送 Evans 蓝染料，诱导从视神经头发出的血管的强烈标记，持续至少 7 天。固定后，可以在共聚焦扫描中测量扁平视网膜整体安装内细胞对之间的真实距离，并与体内像素距离匹配，以确定体内图像的平均像素大小。注射到小鼠眼睛中的荧光微球可以在体内测量微球直径，给出略大的像素尺寸估计，但差异更大。

体内成像可以与免疫染色和原位杂交等组织学分析相结合。这些方法可以识别特定的细胞类型并检查成像细胞的基因表达。