墨西哥鱼基因功能的操纵

洞穴动物为研究各种形态、发育和行为特征提供了一个令人信服的系统。但是，建立这个模型系统的限制因素之一是缺乏基因工具，使我们能够操纵基因功能。在这里，我们演示了三种不同的方法来操纵墨西哥洞穴鱼，Astyanax墨西哥人的基因功能。

这些工具将有助于研究地表鱼和洞穴鱼之间自然变异的基因，以及它们与表型的关系。贝萨尼·斯塔尔，一个在我的实验室里才华横溢的博士后，将证明这个程序。在开始手术之前，将100毫升的培养皿中溶解在鱼系统水中的温3%agarose，并小心地将蛋注模具以45度角放入加糖中，然后慢慢将霉菌放入加糖中，以避免将空气困在模具下。

当加糖凝固后，小心地去除模具，然后在四摄氏度下存放板材长达一周。然后根据制造商的指南，从硅酸盐玻璃毛细管和电极针拉拔器中拔出针头。注射当天，使用玻璃移液器将单细胞卵子转移到注射板中，每排填充多达五行注射板的鸡蛋，每排30至40个鸡蛋。

用少量的鱼系统水保持鸡蛋水合。在冰上解冻Morpholino，并准备注射溶液，以便使用长微加载器移液器尖端或向末端添加2至4微升玻利瓦尔，每个鸡蛋注射400个菲莫利诺的象形图。当所有针头都已加载后，使用钳子修剪注射针尖的多余的长度，然后将第一根针头安装到连接到皮莫利特微注射器的微操纵器中。

然后，将注射盘放在解剖显微镜下，使用微操纵器用针头穿透每个鸡蛋，然后将一纳米升的Morpholino注射溶液直接注射到蛋黄中。对于CRISPR注射，将引导RNA的25个象形图与300个CRISPR相关蛋白9信使RNA的象形图混合，并如所证明，将产生的RNA溶液的两纳米光注入每个胚胎中。对于 Tol2 转置酶和 Tol2 侧翼质粒注射，将 Tol2 信使RNA每微升 25 纳米图与 Tol2 质粒构造的微升 25 纳米图和无 RNase 水中的酚红色相结合。

然后像刚刚证明的，将一纳米升溶液注入每个胚胎。在注射后四天内对莫菲诺注射的动物进行筛查，根据感兴趣的基因，在立体显微镜下对鱼幼虫进行可视化，以观察注射动物的表型或视频记录，以测量行为。要筛选CRISPR内德尔，将CRISPR注射的胚胎移植到PCR管中，然后根据标准DNA提取方案提取DNA，用于聚合酶链反应或PCR分析。

要评估诱变，在 70 伏特的 3%agarose 凝胶上运行 PCR 产品的 5 微升，运行 3 小时。野生型、非突变性DNA将产生一个不同的波段，而突变DNA则会导致污迹带。与注入炒莫罗诺的水面鱼相比，注射了对照莫菲诺的墨西哥鱼在24小时内表现出更多的运动活动，睡眠减少。

与控制注射的鱼相比，低胰蛋白奥里诺的注射对表面鱼的睡眠影响很小。相比之下，通过Morpholino注射的低克雷素或毒素的敲击对洞穴栖息鱼类的睡眠有显著影响，在低克雷素奥林表达和睡眠损失之间提供了直接的联系。表面鱼类中白化病基因OCA2的CRPSR中化突变导致野生型OCA2阳性等位基因的一些个体同源，并且与携带色素沉着有关，而拥有两个CRISPR突变OCA2阴性等位基因的个体是白化病，在洞穴鱼中突变的OCA2基因和白化病之间提供了直接的联系。

选择 F0 的正向，用于 Tol2 传输的转基因回交叉到野生类型，以生成稳定的 F1 线。这支持活钙成像，以揭示神经元活动的差异，调解洞穴环境中的行为变化，为许多其他转基因的表达奠定基础，以描述和操纵墨西哥的基因功能。要记住的最重要的事情是将鸡蛋紧紧地装在盘子上，正确修剪针头，并优化微注射。

在成功的基因敲打、转基因整合或CRISPR中继的基因编辑后，这些鱼可用于发育、行为和大脑活动分析。