O9-1 神经嵴细胞的培养与调控

O9-1细胞系是研究体外神经波峰细胞的非常有用的工具。它具有巨大的应用潜力，用于各种研究用途。O9-1细胞具有明显的优点，如容易获得，并迅速获得足够的细胞数进行实验，因此它是一种强大的方法，可用于神经波峰细胞的体外研究。

首先，根据文本协议，为 O9-1 细胞培养准备基底介质。然后，过滤基底介质，然后用铝箔包裹，以保护其免受光线的光。在此之后，根据文本协议从激活的 STO 单元格收集条件基底介质。

首先，在冰上解冻地下室膜基质的等分两小时。然后，用过滤灭菌的DMEM稀释基底膜基质，用10%FBS稀释为0.5mg/ml的最终浓度。在室温下用基底膜基质涂覆板一小时。

然后，在倾斜板的同时吸气基底膜矩阵。在30摄氏度下干燥盘子30分钟。将基底膜基质添加到板中时，确保溶液均匀覆盖井，以保持细胞特性，避免实验之间出现不必要的变化。

通过将低温瓶放入37摄氏度的水浴中，恢复O9-1细胞。慢慢旋转小瓶，直到溶液完全变成液体。在此之后，将细胞溶液从低温瓶转移到15ml离心管。

将五卷DMEM与10%FBS添加到管子中，以重新悬浮细胞。在180 Gs下将细胞离心3分钟，然后吸气，注意不要干扰颗粒。接下来，在有条件基底介质中重新悬浮颗粒，辅以LIF和BFGF。

将细胞播种在六井板中，搅拌板均匀播种细胞。搅拌板时，水平和垂直地进行，因为旋转板会导致细胞向中心集中。并允许这些细胞在一夜之间在标准细胞培养箱中附着并生长。

在更换介质之前，确保单元格已连接。当 O9-1 细胞达到 80% 汇合时，解冻地下室膜基质，并准备如下所述的基底膜基质涂层板。然后将辅以LIF和BFGF的基底介质添加到膜基质中。

用 2ml 的 DPBS 轻轻冲洗孔两次。然后，在37摄氏度下用1ml的0.05%trypsin EDTA分离细胞，进行三分钟。将液在井的整个表面重复移液，用10%FBS的等量DMEM中和试液。

然后，将细胞溶液转移到离心管。在 180 Gs 下离心三分钟。接下来，通过轻轻点压条件基底介质，辅以LIF和BFGF，重新注入细胞颗粒。

如前所述，将电池播种到涂层板中。然后，让细胞在标准细胞培养箱中附着并生长。首先，根据文本协议准备 2 倍冻结介质。

然后，过滤介质消毒。用 DPBS 冲洗板壁两次，轻轻移液，避免丢失细胞。接下来，在37摄氏度下用0.05%的三辛EDTA分离细胞，三分钟。

用等于 10% FBS 和 DMEM 的粒粒辛中和。将板内物转移到离心管中，在180 G下离心3分钟。再次离心细胞溶液，吸进超吸。

根据需要调整管中基底介质的量，并添加相等数量的 2 倍冻结介质。接下来，将细胞转移到标记的低温小瓶。将冷冻瓶放在带盖子的聚苯乙烯盒内，在 80 摄氏度下实现慢速冷却，至少 24 小时。

要执行S SIRNA击倒在O9-1细胞，恢复和种子细胞。在适当体积的无血清介质中稀释脂质体。然后，根据文本协议在无血清介质中稀释S后娜。

在此之后，根据制造商的说明，将稀释的S后S后，加入稀释的脂质体。通过移液混合溶液，在室温下孵育五分钟。接下来，向细胞中加入适当体积的S SIRNA脂质复合物。

然后，在标准细胞培养箱中孵育细胞24小时。O9-1细胞在特定的分化培养条件下可以分化成不同的细胞类型。为了将O9-1细胞分化成骨质，根据文本协议准备骨质分化介质。

最后，通过免疫染色检测分化骨钙素的骨质标记骨钙素。为了将O9-1细胞分化成平滑肌细胞，根据文本协议在分化介质下培养它们，并评估通过平滑肌肉作用素免疫染色的分化。在该协议中，对O9-1细胞中叶的函数损失进行了敲掉和击倒实验。

在平滑肌肉细胞分化条件下，大多数野生型O9-1细胞产生平滑肌肉作用积极平滑肌肉细胞。Yap null 细胞，但通常不能区分成 SMA 阳性平滑肌肉细胞。这表明，Yap在神经峰细胞分化成平滑肌肉细胞方面起着关键作用。

在尝试此过程时，必须记住在整个过程中温和而小心地处理 O9-1 细胞系。确保正确稀释和使用基底膜基质，并使用0.05%的三辛进行细胞分离。不要忘记，在准备 O9-1 细胞培养时，使用米霉素 c 可能非常危险，执行此程序时应始终采取预防措施，如穿着实验室外套和手套。