木钻甲虫附着物扫描和透射电子显微镜的样品制备方法

木鸟甲虫他们的身体表面总是很难在SEM。Tween-20 被添加到固定和洗涤溶液中。在TEM中，Tween-20的木孔甲虫的身体表面可以增强固定性渗透到身体壁中，更好地固定体内的组织和器官。

荧光显微镜有助于提高切片精度。该技术有助于洗涤身体表面和渗透到木孔甲虫的身体壁。因此，它将清除SEM和TEM的愿景。

荧光显微镜有助于提高TEM的切片精度。演示这个程序的将是来自我们实验室的研究生张燕茹。在氯丙酮卡拉加纳居住的地方，将用植物吸引剂（如等值酮）诱饵的田地陷阱放在漏斗陷阱上。

吸引木虫成人进入陷阱。在 pH 7.2 下，将成人氯氟烃卡拉加纳的清洁身体保持 0.1 摩尔/升 PBS，以体积谷胱甘肽保持 2.5% 的重量，以体积 Tween-20 保持 0.06% 体积。将样品在四摄氏度下固定三天。

从保鲜液中去除尸体，并在 PBS 中冲洗。在立体显微镜下，使用钳子去除附属物，并在PBST中以40千赫的超声波清洁。清洁 100 秒后，将样品转移到显微镜上，检查样品是否清洁。

清洁时间不要超过400秒，以免损坏。然后将样品以一系列浓度浸入乙醇中，每次20分钟进行脱水。脱水后，在立体显微镜下，使用碳双面胶带将三个观察表面（后侧、腹体和侧侧）分别固定到存根上。

确保所有观察表面保持清洁且无污染。将样品阶段放在含有硅胶干燥剂的培养皿中 48 小时。接下来，在离子溅射器上，将主阀旋转到打开位置，拆下样品室盖，将样品放入腔室。

打开电源开关，确保就绪指示灯已打开。将溅射时间设置为 45 秒，将涂层厚度设置为 70.875 安热罗姆。一旦机械泵真空表盘指数降至 7 以下，按压放电并开始喷洒铂金。

在步骤结束时，关闭电源，将样品从腔室中带走。计算喷雾膜厚度 D 等于 K 倍的 T.K 是由溅射金属和气体决定的常数。I 是等离子流量（以毫安为单位），而 V 是施加的千伏电压，T 是时间（以秒为单位）。

将包含样品的存根插入 SEM 的阶段。确保样品存根的样本阶段有足够的高度，以便获得良好的图像。打开 SEM 软件并选择从 20 千伏开始的所需工作电压。

从成人氯氟氏菌类获得附属物后，在超声波浴中清洗PBST中的样品三小时，然后在25摄氏度下用PBS中的三氧化二氮体积将样品以1%的重量固定一小时。在室温下连续处理20分钟，在室温下用体积乙醇脱水样品，50%60%70%80%85%90%90%100%和100%体积。使用钳子，将加热树脂涂抹在扁平嵌入模具中，并将样品嵌入树脂中。

确保样品位于板的底部，并尽可能靠近凹槽的边缘。在60摄氏度下标记并孵育含有样品的板，72小时。孵育后，从培养箱中取出板，并验证树脂是否已聚合。

样品凝固后，将每个树脂块置于荧光显微镜下，移动显微镜的荧光光源，从上方用蓝光照射样品并拍摄。确保树脂块中的感官清晰可见。测量树脂块边缘与目标传感器之间的距离，以定位感官。

参考小巴的SEM图像，用靠近目标受体的剃须刀切割树脂块。接下来，在蓝光荧光显微镜下，从上面调整光源，以便清晰观察感官。将目标千分尺添加到荧光显微镜阶段。

拍摄大致切割的树脂块，然后使用 ImageJ 测量目标与树脂边缘之间的距离。将树脂样品放在超微体上，切割 50 至 60 纳米厚的部分，直到达到目标位置。在 Petri 盘中安装涂有外衣涂层的 100 个网状铜网格上的部分。

在室温下用饱和的醋酸化溶液染色网格。在染色过程中盖住各部分，以阻挡由光线引起的沉淀物。污渍10分钟。

在烟气罩中，用50%甲醇冲洗两次，然后在过滤后气水中冲洗两次。将准备好的铅柠檬酸盐污渍滴在塑料培养皿的方块上，让它们坐8分钟。用脱气过滤水冲洗并干燥。

将网格安装到 TEM 机器内的样品级。将电压设置为 80 千伏，并检查各部分。在此协议中，使用 Tween-20 的清洁和固定解决方案，观察到比没有 Tween-20 的清晰的 SEM 图像。

Tween-20 固定溶液允许谷胱甘肽固定溶液穿透组织，在 TEM 图像中清楚地看到微管结构，而未制备的 Tween-20 样品的内部结构模糊不清。第一型尖牙树枝在最大唇上的钉钉的连续横截面视图显示，树突状护套包围着外树突状段，并延伸到尖端孔隙。七个未分的外突状片段存在于被外腔包围的内受体淋巴腔内。

管状体由树突护套与每个森硅插座基座的其他外树突状段隔开。在硅体区域，确定了8个不同直径的树突，表明存在8个双极神经元。该技术可用于进一步研究神经的功能，如单细胞记录或原位杂交。