나무 보링 딱정벌레 그들의 몸 표면은 항상 SEM에서 어렵다. Tween-20은 고정 및 세척 용액에 추가됩니다. TEM에서 목보링 딱정벌레의 신체 표면, Tween-20 신체 벽에 고정 침투를 향상 하 고 더 나은 본문에 조직 및 장기를 수정 할 수 있습니다.
형광 현미경은 슬라이스 정확도를 향상시키는 데 도움이됩니다. 이 기술은 몸 표면을 씻고 나무 보링 딱정벌레의 체벽에 침투하는 데 도움이됩니다. 따라서 SEM 및 TEM 비전을 지웁시게 됩니다.
형광 현미경은 TEM에서 슬라이스 정확도를 개선하는 데 도움이됩니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 대학원생 장 얀루가 될 것입니다. 클로로포루스 카라가나(Chlorophorus caragana)가 살고 있는 지역에서는 깔때기 트랩에 이소포론과 같은 식물 매력이 있는 필드 트랩을 배치합니다.
나무 지루한 딱정벌레 어른을 함정에 끌어들입니다. 성인 클로로포루스 카라가나의 깨끗한 몸을 pH 7.2, 부피 글루타랄데히드2.5%, 볼륨+2000000000리터 PBS 당 0.1두더지보존. 샘플을 섭씨 4도에서 3일 동안 수정합니다.
보존 액체에서 시체를 제거하고 PBS에서 헹구는 다. 스테레오 현미경에서, 부속물을 제거하고 PBST에서 40 킬로 헤르츠에서 초음파로 청소하는 집게를 사용합니다. 100초 동안 세척한 후 샘플을 현미경으로 전송하여 깨끗한지 확인합니다.
손상을 피하기 위해 400초 이상 청소하지 마십시오. 그런 다음 각각 20 분 동안 일련의 농도로 에탄올에 샘플을 담그고 탈수를 수행하십시오. 탈수 후 스테레오 현미경 으로 탄소 양면 접착 테이프를 사용하여 세 가지 관측 표면, 등쪽, 복부 및 측면, 스텁에 별도로 고정하십시오.
모든 시야 표면이 오염이 없도록 청결하고 오염이 없도록 하십시오. 샘플 스테이지를 실리카 젤 건조제를 48시간 동안 함유한 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, 이온 스퍼터링 기기에서 메인 밸브를 열린 위치로 회전시키고, 샘플 챔버 커버를 제거하고 샘플을 챔버에 넣습니다.
전원 스위치를 켜고 준비 된 조명이 켜져 있는지 확인합니다. 스퍼터링 시간을 45초로 설정하고 코팅 두께를 70.875 앙스트롬으로 설정합니다. 기계식 펌프 진공 다이얼 인덱스가 7이하로 떨어지면 방전을 누르고 백금 분무를 시작합니다.
절차가 끝나면 전원 공급 장치를 끄고 샘플을 챔버에서 꺼내십시오. K 시간 T.K와 동등한 앙스트롬에서 스프레이 필름 두께 D를 계산하면 스퍼터링 된 금속 및 가스에 의해 결정되는 상수입니다. V는 킬로볼트에 가해지는 전압이고 T는 초 단위로 시간인 동안 밀리앰프의 플라즈마 흐름입니다.
샘플을 포함하는 스텁을 SEM 의 단계에 삽입합니다. 샘플 스텁이 있는 샘플 스테이지에 좋은 이미지를 허용하기에 충분한 높이가 있는지 확인합니다. SEM 소프트웨어를 열고 20킬로볼트에서 원하는 작동 전압을 선택합니다.
성인 클로로포루스 카라가나에서 부속물을 얻은 후, 3시간 동안 초음파 욕조에서 PBST의 샘플을 세척한 다음 PBS의 부피 osmium 테트락옥사이드를 섭씨 25도에서 1시간 동안 1%의 무게로 수정합니다. 실온에서 부피 에탄올에 의해 50%60%70%80%80%85%90%와 100%의 부피로 20분 연속 처리를 사용하여 샘플을 탈수한다. 집게를 사용하면 가열 된 수지를 평평한 포함 금형에 바르고 수지에 샘플을 포함시면 됩니다.
샘플이 플레이트 의 맨 아래에 있고 오목한 홈의 가장자리에 가능한 한 가깝게 배치되었는지 확인합니다. 라벨을 부착한 다음 샘플을 포함하는 플레이트를 섭씨 60도에서 72시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 수지가 중합되었는지 확인합니다.
시료가 고화되면 각 수지 블록을 형광 현미경 아래에 놓고 현미경의 형광원을 이동하여 위에서 푸른 빛으로 샘플을 조사하고 사진을 찍습니다. 수지 블록의 센실라가 명확하게 표시되는지 확인합니다. 수지 블록의 가장자리와 대상 센서 사이의 거리를 측정하여 센실라를 대상으로 합니다.
팔프의 SEM 이미지를 참조하고 표적 수용체에 가까운 면도날로 수지 블록을 대략 자른다. 다음으로, 청색광형 현미경검사의 밑에, 센실라가 명확하게 관찰되도록 위에서 광원을 조정합니다. 형광 현미경 단계에 객관적인 마이크로미터를 추가합니다.
대략 절단 수지 블록을 촬영한 다음 ImageJ를 사용하여 대상과 수지의 가장자리 사이의 거리를 측정합니다. 수지 샘플을 초미세토메에 놓고 목표 위치에 도달할 때까지 50~60나노미터 두께의 단면을 잘라냅니다. 페트리 접시에 폼바 코팅 100 메쉬 구리 그리드에 섹션을 마운트합니다.
실온에서 우란 아세테이트의 포화 필터링 된 용액으로 그리드를 얼룩. 염색 중 단면을 덮어 빛으로 인한 침전을 차단합니다. 10 분 동안 얼룩.
연기 후드에 50%의 메탄올에 두 번 헹구고 여과 된 탈가물에서 두 번 헹구습니다. 준비된 납 구연산 얼룩을 플라스틱 페트리 접시 의 사각형에 놓고 8 분 동안 앉게하십시오. 탈가물 여과된 물에 헹구고 건조합니다.
그리드를 TEM 기계 내의 샘플 스테이지에 마운트합니다. 전압을 80킬로볼트로 설정하고 단면을 검사합니다. 이 프로토콜에서는 Tween-20을 사용하여 세척 및 고정 솔루션을 사용하여 Tween-20이 없는 것보다 명확한 SEM 이미지가 관찰되었습니다.
트웬-20 고정 용액을 통해 글루타랄데히드 고정 용액이 조직을 관통할 수 있게 되면서, TEM 이미지에서 마이크로튜블러 구조가 명확하게 보였고, Tween-20 없이 제조된 시료의 내부 구조는 흐릿했다. 상악 팔프에 있는 1형 센실라 나뭇가지 바시카의 페그(peg)의 연속 단면 전경은 수지상 칼집이 외부 수지상 세그먼트를 둘러싸고 팁 모공으로 확장된 것으로 나타났다. 7개의 분기되지 않은 외부 수지상 세그먼트는 외부 구멍에 둘러싸인 내부 수용체 림프구멍 안에 존재했습니다.
관 체는 각 센실라 소켓 베이스의 다른 외부 수지상 세그먼트에서 수지상 칼집에 의해 분리되었습니다. 섬모 영역에서, 다른 직경의 8 개의 점원8 은 8 개의 양극성 뉴런의 존재를 나타내는 확인 되었다. 이 기술은 단일 세포 기록 또는 시상 혼성화와 같은 신경의 기능을 추가로 연구하는 데 사용될 수 있다.
