我们关于体外转录RNA的荧光素酶测定的协议有助于研究痘病毒感染细胞的转化调控。此外，Poly（A）升的定制长度允许研究其对翻译的监管影响。该技术的主要优点是，它允许研究Cis元素的翻译调控，如5'UTR和3'UTR在mRNA和广泛的翻译启动。
体外转录RNA基荧光素酶检测方法可进行定制，以纳入对盖和其他修饰的修改，并用于测试对翻译的影响。首先，设计前进和反向底转，以生成包含以下元素的 PCR 放大器，方向为 5'到 3'：T7-促进器， 聚（A）升，萤火虫路西加酶 ORF 在聚（A）尾称为T7_12A-Fluc，包括几个额外的核苷酸在前进底转，其次是T7-促进器聚（A）升或所需的5'UTR序列和大约20核苷酸对应于5'端的记者基因的OF。根据与报告基因的 ORF 的 5'端对应的熔化温度调整底因长度，确保底源器中的相应区域与基因的感应链相同。
然后设计反向底转，包括聚（A）尾和大约20个核苷酸。根据与报告基因的 ORF 的 3'end 对应的熔化温度进行调整，确保底原体的相应区域与基因的反感链相同，且在 Poly（A） 尾部之前存在帧内停止 codon。对于内部控制，设计另一组底像，包含以下元素在5'到3'方向：T7-启动器，一个随机的5'UTR编码序列包含科扎克序列，雷尼拉路西法酶 ORF和聚（A）尾，称为T7_Kozak-Rluc。
要设置反应，请按以下顺序将试剂添加到 PCR 管中：无脱水、2X 高保真DNA聚合酶、底注和序列确认的荧光素酶模板 DNA。经过标准的三步PCR循环生成DNA模板后，通过运行5-10%的PCR反应，在1%的agarose TAE凝胶电泳和分子量标准中检测PCR产品。要确定 PCR 产品的大小，请将凝胶可视化为紫外线照明器下。
在确定 PCR 产品的正确尺寸后，使用市售的 PCR 纯化套件使用 100 微升无核酸酶无素水进行纯化，以检测 DNA。使用分光光度计检查纯化DNA的浓度，并将其储存在零下20摄氏度，立即用于体外转录。要从PCR产品合成RNA，请将以下试剂加入微离心管：DNase-RNase无水、NTP缓冲液混合、帽模拟、PCR产品模板和体外转录试剂盒中的T7-RNA聚合酶混合。
彻底混合。在37摄氏度下孵育两小时，然后使用RNA纯化试剂盒进行合成RNA的纯化。要检查纯化的RNA，在70度加热RNA5分钟，去除二次结构，并在1.5阿加罗斯TBE凝胶上运行。
然后在紫外线照明器下可视化凝胶。使用分光光度计检查纯化RNA的浓度。阿里语，储存在零下80摄氏度。
在24个井板中播种 HeLa 细胞，第二天达到 80-90% 的汇合，并在 37 摄氏度的培养箱中孵育过夜，二氧化碳含量为 5%。感染HLA细胞与瓦奇尼亚病毒在五个感染的多重和保持未感染的希拉细胞进行比较。然后在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育，10至12小时。
感染后所需小时后，将12A序列的480纳米图与携带萤火虫路西法酶mRNA的180纳米图和携带蕾妮拉路西法酶mRNA的20纳米图混合在一个微离心管中。在另一个微离心管中，加入1.1微升的阳离子脂质转染试剂。将 55 微升的减少血清介质添加到两个管中，在室温下混合和孵育五分钟。
然后加入55微升阳离子脂质转染试剂含有减少血清介质到mRNA包含管。与移液器轻轻但彻底混合，在室温下孵育15分钟。在孵育过程中，从细胞中去除细胞培养培养，每井加入400微升的血清培养。
孵育完成后，在24个井板的井中，每井均匀地加入100微升混合物滴。与12A Fluc和Kozak Rluc mRNA共同感染后5小时，从细胞中去除还原的血清介质，通过从Luciferase测定试剂盒中加入150微升1X解液缓冲液来细胞酶化。在室温下孵育10分钟后，使用橡胶和无菌注射器刮取细胞，并转移到微离心管。
为了颗粒细胞碎片，在摄氏4度下将12，000次的落酸离心10分钟。每井输送30微升清量，用于具有坚固底部的不透明壁壁96井白色测定板。使用路西法酶测定套件和多模板读卡器发光计使用手稿中描述的动力学功能测量双发光。
将发光读取数据导出为理想的文件格式后，通过将 Fluc 值除以内部控制 Rluc 值，确定未感染和 VACV 感染 HeLA 细胞中的 12A Fluc mRNA 的相对平移率。此检测用于测试在未感染和 VACV 感染的细胞中含有 5'Poly（A） 升的 Fluc mRNA 的翻译效率。未感染细胞和VACV感染细胞均成功与氟克和Rluc mRNA共同感染。
将氟化物除以Rluc使细胞RNA稳定性的转染效率正常化。与未感染的细胞相比，5'Poly（A）升含有mRNA在VACV感染期间具有转化优势。这不是由于差异转染效率或mRNA稳定性，因为RNA水平在未感染和VACV感染细胞中相似，在mRNA转染后5小时。
在设计底像时要特别小心，因为这不仅会影响 PCR 反应效率，还会影响所有需要扩增 DNA 的下游过程。该方法是快速测试Cis元素翻译规制的重要检测方法。如果可能，此方法应得到其他补充实验的证实。
使用瓦奇尼亚病毒时应采取预防措施，避免接触溴化乙基和苯酚等化学物质。
