Наш протокол для in vitro транскрибируется РНК основе анализа люциферазы помогает изучить регулирование перевода в вирусе оспы инфицированных клеток. Кроме того, настраиваемая длина Поли (A)liter позволяет изучить его регулятивное воздействие на перевод. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет изучать регулирование перевода элементами Cis, такими как 5'UTR и 3'UTR в mRNA и широким спектром инициирования перевода.
In vitro транскрибируется РНК основе luciferase репортер анализ может быть адаптирована для включения модификации крышки и других модификаций и используется для проверки влияния на перевод. Для начала, дизайн вперед и обратной грунтовки для создания PCR amplicon, содержащий следующие элементы в 5'to 3'direction:T7-Promoter, Поли(A)литровый, Светлячок Luciferase ORF в Поли(A) хвост называют T7_12A-Fluc, включают в себя несколько дополнительных нуклеотидов в перемотке вперед следуют T7-Promoter Poly (A) литр или желаемого 5'UTR последовательности и около 20 нуклеотидов, соответствующих 5'end orF репортера гена. Отрегулируйте длину грунтовки на основе температуры плавления, соответствующей 5'концу ORF гена репортера, гарантируя, что соответствующая область в грунтовки идентична чувственной нити гена.
Затем спроектировать обратную грунтовку, чтобы включить Поли (A)хвост и около 20 нуклеотидов. Отрегулируйте на основе температуры плавления, соответствующей 3'end ORF гена репортера, гарантируя, что соответствующая область грунтовки идентична антисенсовой нити гена и в кадре стоп-кодон присутствует перед Poly(A) хвост. Для внутреннего контроля, дизайн другого набора грунтовки, содержащие следующие элементы в 5'to 3'direction:T7-Promoter, случайные 5'UTR кодирования последовательность, содержащая последовательности Козак, Ренилла Luciferase ORF, и Poly (A) хвост, называемый T7_Kozak-Rluc.
Чтобы настроить реакцию, добавьте реагенты в следующем порядке в трубку ПЦР: бесплатная вода DNase, полимераза ДНК 2X высокой точности, грунтовки и последовательность подтвержденной ДНК шаблона люциферазы. После стандартного трехстугового цикла ПЦР для создания шаблона ДНК, обнаружить продукт ПЦР, запуская 5-10% реакции ПЦР в 1%agarose TAE гель электрофорез вместе с молекулярным стандартом веса. Чтобы определить размер продукта ПЦР, визуализировать гель под ультрафиолетовым осветителем.
После определения правильного размера продукта ПЦР, очистить его с помощью коммерчески доступного комплекта очистки ПЦР с использованием 100 микролитров нуклеазы свободной воды, чтобы elute ДНК. Проверьте концентрацию очищенной ДНК с помощью спектрофотометра и храните ее при температуре минус 20 градусов по Цельсию для немедленной использования для транскрипции in vitro. Чтобы синтезировать РНК из продукта ПЦР, добавьте следующие реагенты в микроцентрифугную трубку: бесплатную воду DNase-RNase, буферную смесь NTP, аналог крышки, шаблон продукта PCR и смесь полимеразы T7-RNA из комплекта транскрипции in vitro.
Тщательно перемешать. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов, а затем приступить к очистке синтезированной РНК с помощью комплекта очистки РНК. Чтобы проверить очищенную РНК, нагрейте РНК при температуре 70 градусов в течение пяти минут, чтобы удалить вторичную структуру и запустить его на 1,5 агарозы TBE гель.
Затем визуализируете гель под ультрафиолетовым осветителем. Проверьте концентрацию очищенной РНК с помощью спектрофотометра. Aliquot его и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Семена HeLa клетки в 24 хорошо пластины для достижения 80-90%слияния на следующий день и инкубировать на ночь в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Заразить heLa клетки с вирусом Vaccinia на множественность инфекции 5 и держать неинфицированные клетки HeLa для сравнения. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию с 5% углекислого газа в течение 10 до 12 часов.
После желаемых часов после инфекции, смешать 480 нанограммов последовательности 12A подшипник Светлячок Люцифераза мРНК и 20 нанограммов последовательности Козак подшипника Ренилла Люцифераза мРНК в одной микроцентрифуг трубки. В другую микроцентрифугную трубку добавьте 1,1 микролитров катионные липидные трансфекции реагента. Добавьте 55 микролитров пониженного средства сыворотки в обе трубки, смешайте и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем добавьте 55 микролитров катионные липидные трансфекции реагент, содержащий уменьшенный сывороточный медиа, в мРНК, содержащую трубку. Смешайте осторожно, но тщательно с пипеткой и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Во время инкубации удалите из клеток среду клеточной культуры и добавьте 400 микролитров пониженной среды сыворотки на колодец.
Когда инкубация завершена, добавить 100 микролитров смеси падение мудрым и равномерно на колодец из 24 хорошо пластины. Пять часов после совместной трансфекции с 12A Fluc и Kozak Rluc mRNA, удалить уменьшенную среду сыворотки из клеток и подлизать клетки, добавив 150 микролитров 1X лиза буфера из luciferase анализ комплект, способный выполнять два анализа репортера. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре, соскребать клетки с помощью резиновых и стерильных шприцев и передачи в трубку микроцентрифуг.
Чтобы гранулировать клеточный мусор, центрифуга лисировать при 12 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Передача 30 микролитров супернатанта на колодец непрозрачной стеной 96 хорошо белый анализ пластины с твердым дном. Используйте набор анализа Люциферазы и мульти-режимный люминометр считывателя пластин для измерения двойной люминесценции с использованием функции кинетики, описанной в рукописи.
После экспорта данных чтения люминесценции в желаемый формат файла определите относительную скорость перевода с 12A Fluc mRNA в неинфицированных и VACV инфицированных клетках HeLA, разделив значение Fluc на значение внутреннего контроля Rluc. Этот анализ был использован для проверки эффективности перевода флюк-мРНК, которая содержит 5'Poly(A) литр в неинфицированных и VACV инфицированных клеток. Как неинфицированные, так и ВАКВ инфицированные клетки были успешно совместно трансфицированы с Fluc и Rluc mRNA.
Разделение Fluc Rluc нормализовало эффективность трансфекции в стабильности РНК в клетках. 5'Poly(A)liter, содержащий мРНК, имеет трансляционные преимущества во время инфекции ВАКВ по сравнению с неинфицированными клетками. Это не было связано с дифференциальной эффективностью трансфекции или стабильностью мРНК, поскольку уровень РНК был аналогичен в неинфицированных и инфицированных клетках ВАК через пять часов после трансфекции мРНК.
При проектировании грунтовок особое внимание при проектировании праймеров может повлиять не только на эффективность реакции ПЦР, но и на все процессы ниже по течению, требующие усиленных ДНК. Этот метод является важным анализом для быстрого тестирования регулирования перевода элементами Cis. Если это возможно, этот метод должен быть подтвержден другими дополнительными экспериментами.
Меры предосторожности следует принимать при использовании вируса Vaccinia и избегать воздействия химических веществ, таких как бромид этидия и фенол.
