使用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

微生物群分析是确定微生物群在健康和疾病中的作用的第一步。在这里，我们描述了一个简单的程序，从粪便样本制备库中隔离高质量的细菌DNA，执行16SR RNA和元基因组测序和微生物群数据分析。该协议将帮助微生物群领域的研究人员，以及微生物群领域的研究人员在他们的实验室中建立微生物群管道。此协议可以扩展，用于从其他生物标本（如动物和人类受试者的鼻、口或皮肤样本）分析微生物群。珠采摘是最重要的步骤，因为所有下游步骤都依赖于高质量的DNA。正确密封保全板非常重要，因为密封不全可能导致放大产品的压迫，从而导致测序数据质量低。首先，用70%乙醇对分压器盒进行消毒。将小鼠放在消毒的分频器盒中，并允许它们正常排便长达一小时。使用无菌钳子在空预标记的 1.5 毫升微型离心管中收集粪便颗粒。将管子牢固地封闭。在从每只小鼠收集粪便后，用70%乙醇对钳子进行消毒，然后进行杀菌一次性擦拭。将 200 毫克粪便颗粒重入 1.5 毫升微型离心管中，用 0.1 毫升玻璃珠，将珠管放入珠子中，在室温下以 4.5 米/秒的速度均匀化样品 45 秒。根据试剂盒制造商的说明提取脱氧核糖核酸，并在1.5毫升微离心管中提取DNA。分离DNA后，通过将1微升DNA加载到荧光计上来量化分离的DNA。使用 25 微升反应体积在 96-Well PCR 板中设置 16S 核糖体 RNA 基因扩增 PCR1。使用多通道移液器，加入40纳米克DNA，13.5微升2倍高保真聚合酶混合物，含有缓冲液，加上TSP在正向和反向底塑。将 PCR 板沿所有四条边缘从顶部到底部正确密封。离心机在 1000 倍 G 在 20