<p class="jove_title">逆转录反应</p><p class="jove_content">关闭加热块到70-80 ° C和42 ° C。水浴也可以用在这一步。如果使用加热块，放一些水，使热量均匀。 </p><ol><li>底漆反应<ol><li>取3微克的RNA </li><li>调整音量与核糖核酸酶自由水至13μL </li><li>加入2.5μL的六聚体随机引物（2mg/mL） </li></ol></li><li>搅拌均匀，在70-80℃孵育8分钟。然后，放置在冰浴5分钟。 </li><li>准备RT鸡尾酒（14.5μL/ RXN）： <br /><br /><table border="0"><tbody><tr><td> <strong>组件</strong> </td><td> <strong>卷</strong> </td></tr><tr><td> 5X第一链缓冲</td><td> 6μL </td></tr><tr><td> 0.1中号数码地面电视<br /></td><td> 3μL </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl dNTP混合液</td><td> 1.2μL </td></tr><tr><td>标II RT（200U/μl） </td><td> 2.3μL </td></tr><tr><td>水<br /></td><td> 2.0μL </td></tr></tbody></table><br /> * n个反应，准备为n等分0.5鸡尾酒法师组合，以保证你不会用完。 <br /><br /></li><li>加入14.5μL冷却反应。 </li><li>混合（不要旋涡），并在42 ° C孵育3-4小时</li><li>如有必要，样品可以储存在-20 ° C。 </li></ol><p class="jove_title">水解的RNA </p><ol><li>每个样品中，添加3μL的1 N NaOH和0.6μL0.5 M EDTA。 （最后conc.s = 100MM 10MM EDTA的氢氧化钠，） </li><li>混合并孵育65 ° 10分钟。 </li><li>加入33.6μL1M HEPES中性，pH值= 7.0（终浓度.= 500MM HEPES） </li><li>样品可以储存在-20 ° C，如有必要。 </li></ol><p class="jove_title">反应净化：清除非法人AA -的dUTP和自由胺</p><p class="jove_content"> <em>注</em> ：此净化协议是从Qiagen公司的QIAquick PCRpurification套件协议的修改。 Qiagen公司提供的缓冲区，因为Qiagen公司的缓冲区包含自由竞争与CY染料偶联反应的胺取代磷酸盐的洗涤和洗脱缓冲液。也可用于从小型预习套件列。 </p><ol><li> 300μL（或5X反应体积= 336μL）缓冲液PB（QIAGEN提供）混合cDNA反应，并转移到QIAquick列。 </li><li>将在2 ml收集管中柱（QIAGEN提供）离心1分钟〜13000 RPM。清空收集管。 </li><li>要洗净，加750μL磷酸盐缓冲液洗（不Qiagen公司）列和离心1分钟〜13000 RPM。 </li><li>清空收集管，重复750μL洗涤和离心步骤。 </li><li>清空收集管，并以最大的速度增加1分钟离心列。 </li><li>列转移到一个新的1.5 ml离心管，小心地添加30μL磷酸盐洗脱缓冲液。 （见溶液的制备部分） </li><li>孵育1分钟室温。 </li><li> 1分钟〜13000 RPM离心洗脱。 </li><li>第二次（与其他磷酸盐洗脱缓冲液30μL）重复步骤6-8到同一管流出。最终洗脱体积应〜60μL。 </li><li>在这个阶段，可以量化的cDNA量： <br />吴的cDNA =（稀释倍数）（OD260）（37）（总量列洗脱） </li><li>干样的速度在45 VAC ° C。 </li><li>如有必要，样品可以储存在-20 ° C。 </li></ol><p class="jove_title">耦合AA基因CY染料酯</p><ol><li>悬浮aminoallyl标记的cDNA 10μL50毫米钠碳酸氢盐，pH值= 9.0，如果必要的。 （此缓冲区应该是新鲜，每两个星期） </li><li>在黑暗的地方工作，加上适当的Cy染料管探头。吸取最多几次悬浮染料。 </li><li>反应在室温避光孵育1小时。 （孵化可以去两个小时） </li></ol><p class="jove_title">反应净化：去除耦合染料</p><ol><li>添加35μL100毫米NaOAc pH值5.2的反应。调匀。 </li><li>加入250μL（或5X反应体积= 225μL）缓冲区PB（QIAGEN提供）上下吹打每个样品和混合。 </li><li>将在2毫升收集管QIAquick离心柱（QIAGEN提供），适用于样品列，离心1分钟〜13000。清空收集管。 </li><li>要洗净，加0.75 mL缓冲液PE（QIAGEN提供）1分钟〜13000列和离心机。 </li><li>重复步骤4。 </li><li>空集合管和离心机以最大的速度增加1分钟的列。 </li><li>地点列在一个干净的1.5 ml离心管，小心地加入30μl的缓冲液EB（QIAGEN提供）列膜的中心。 </li><li>孵育1分钟室温。 </li><li> 1分钟〜13000 RPM离心洗脱。 </li><li>重复第二次到同一管流出步骤7-9。最后的洗脱体积应〜60μL。 </li></ol><p class="jove_title" align="left">标记反应分析</p><p class="jove_content" align="left">在这个阶段可以量化的cDNA量和标签： </p><ul><li>测量外径260，550和650（空白是水。）使用nanodrop的芯片方案。 </li><li>计算pmol染料掺入pmol的DNA与国统会/染料的比例给予下面公式： <br /><br /> pmol核苷酸= [OD260 *量（μl）* 37毫微克/μL* 1000皮克/ NG] / 324.5 PG / pmol </li></ul><p class="jove_content"> <em>注</em> ：1 OD260 = 37纳克/μLcDNA的; 324.5 pg / pmol的一个dNTP的平均分子量） <br /> pmol Cy3标记= OD550 *量（μl）/ 0.15 <br /> pmol Cy5的量（μl）/ 0.25 = OD650 <br />核苷酸/染料比率= pmol的cDNA / pmol赛扬染料</p><p class="jove_content">如果您正在使用nanodrop的，它已经给每个染料pmol /μL。你只需要这个数字乘以数量得到总pmo​​l染料掺入。 </p><p class="jove_content"> <em>注</em> ：&gt; 150-200 pmol染料掺入每个样品的比例小于20个核苷酸/染料分子杂交的最佳选择。 </p><ul><li>在黑暗的样品可以储存在-20 ° C。 <ul><li>结合探针杂交在一起，干倒在Speed​​Vac在42 ° C。 </li><li>样品可以储存在-20 ° C，直到准备来HYB。 </li></ul></li></ul><p class="jove_title">前HYB幻灯片</p><ol><li>放置滑面，跌幅超过RT 100毫升水3-5分钟，在一个干净的红色幻灯片持有人</li><li>对齐干，放置在100℃加热块面对几秒钟的幻灯片 - 手表凝结消失</li><li>紫外光交联在250 mJoules幻灯片（紫外线交联剂输入2500） </li><li>预热42℃的热水中浸渍水合物的幻灯片。旋转700 RPM在室温5分钟。 </li><li>孵育于50ml Coplin JAR幻灯片包含至少45分钟的预热预HYB（5XSSC，1％BSA，0.1％SDS）@ 42 ° C，并且潜伏期可以去如果必要的时间。 <br /><br /> 50毫升HYB前缓冲区：12.5毫升20X SSC，10毫升5％BSA，0.5毫升10％SDS，27 mL水<br /><br /></li><li> DIP幻灯片和预热水（42℃）搅拌几分钟删除前HYB缓冲区。 </li><li>异丙醇冲洗和旋转700 RPM，室温，干燥5分钟。 </li></ol><p class="jove_title">准备样品杂交</p><ol><li>悬浮在水中的探头（卷下面给出） <br /><br /><table border="0"><tbody><tr><td>对于总卷。 =30μl <br /></td><td>对于总卷。 =35μl <br /></td><td>总卷.=40μl <br /></td><td></td></tr><tr><td> 19.8μL水<br /></td><td> 23.55μL水<br /></td><td> 27.2μL水<br /></td><td><br /></td></tr><tr><td> 1.5μL </td><td> 1.5μL </td><td> 1.5μL </td><td> 10毫克/毫升的鲑鱼精子DNA（Invitrogen公司） </td></tr><tr><td> 1.2μL </td><td> 1.2μL </td><td> 1.2μL </td><td> 12.5毫克/毫升的tRNA </td></tr><tr><td> 4.5μL </td><td> 5.25μL </td><td> 6μL </td><td> 20XSSC（3X最后） </td></tr><tr><td> 3μL </td><td> 3.5μL </td><td> 4μL </td><td> 1％SDS </td></tr></tbody></table><br /> <em>注</em> ：此外试剂的顺序是很重要的。不要准备预混。 <br /><br /></li><li>煮沸5分钟，然后旋转14000转5分钟。室温2分钟冷却。 </li></ol><p class="jove_title">杂交</p><ol><li>加入10-12μl的3倍SSC的每个边缘和中间的杂交室井。 </li><li>添加清洁升降机滑幻灯片的适当区域，并在杂交液轻轻加载（30 -40μL）。应该有额外的样品任盖玻片边缘。 </li><li>放置在会议厅内的幻灯片。拧紧螺钉和​​地方在65℃水浴过夜。不要直接放在水浴底部的腔。至上腔顶部放置一个块保存一切就绪。继续水浴盖子保护光敏感的样品。 </li></ol><p class="jove_title"> HYB洗</p><ol><li>准备以下的缓冲区： <ul><li> 1X SSC，0.05％SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li>孵化后启封杂交室。从试验箱中取出的幻灯片，小心不要打扰盖玻片。 </li><li>要删除盖玻片，淹菜中含有温暖1X SSC，0.05％SDS的缓冲液洗盖玻片面临的菜底部的幻灯片。盖玻片会脱落移动幻灯片一边到另一边。 </li><li>盖玻片后取出，放置在一个温暖1XSSCm 0.05％SDS的机架新鲜浴的幻灯片。鼓动几分钟</li><li>将幻灯片加上机架0.06 X SSC洗澡。 </li><li>幻灯片传输到另一个BA日的0.06 X SSC包含一个新的机架，在纸巾上的印迹幻灯片之前删除尽可能多的SDS含缓冲区尽可能放置在新鲜浴。 </li><li>搅拌几分钟的幻灯片。 </li><li>立即在室温下自旋为5分钟700转，然后幻灯片准备扫描。商店在黑暗中，直到扫描。 </li></ol>

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	<li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for.">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> <em style='font-style: italic'>Microarrays &amp; TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization</em>. , .</li><li>Gilbert, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+&amp;+Hybridization+of+probed+labels.">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays &amp; Hybridization of probed labels.</a> , .</li><li>Hedge, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II.">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , .</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AA-dUTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A0410</td>
<td>5-(3-aminoallyl)-2&#x2019;deoxyuridine-5&#x2019;-triphosphate</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2035-01</td>
<td>100 mM dNTP Set PCR grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Random Hexamer primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2166-01</td>
<td>3mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript III RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>80800444</td>
<td>200U/&#x03BC;L</td>
</tr>
<tr>
<td>CyDye&#x2122;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAquick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>PCR Purification kit</td>
</tr>
<tr>
<td>1M K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KPO4</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:
9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate wash buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.
** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate elution buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Carbonate Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.
Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

bacterial gene expression analysis using microarrays

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使用微阵列的细菌基因表达分析