免疫标记肾组织的光学清除与成像

对研究大型多细胞结构的兴趣日益增长，导致这种光学清除技术的发展，使透明器官内的大型结构能够进行三维可视化和定量。该协议提供了一个简单，便宜，易于设置和全面的工具，以调查组织在三个维度。传统的二维技术不能总是模拟疾病的多层性质。

组织三维分析有助于更好地诊断和监测疾病。此方法不限于肾脏组织，可应用于任何正常和患病组织。对于任何在动物处理方面有一定经验的科学家来说，这个简单的协议都很容易理解。

在抗体标签不良的情况下测试不同的抗体非常重要，并且只进行二级抗体控制。首先根据手稿说明在 1X PBS 中制备含有 PBS 和 3.0% 甲醛的肝素，并将溶液转移到单独的 50 mL 塑料注射器中。甲醛是有毒的，应在烟气罩中准备。

根据手稿指示收集和大量肾脏。然后，取出胶囊，将肾脏切成一毫米厚的日冕片。将肾片与准备好的甲醛溶液一起浸入15 mL锥形管中。

固定后，用1X洗涤缓冲液在水平摇杆上洗洗肾片两次，然后进行抗原检索。在 500 mL 烧杯中加热 300 mL 的 1X 抗原解质溶液。然后，将肾片封闭在可渗透到加热缓冲液的嵌入盒中，并在 92 至 98 摄氏度下搅拌一小时。

对于此抗原检索步骤，保持温度稳定在 92 至 98 摄氏度之间非常重要。然后将切片转移到 10 mL 的 1X 洗涤缓冲液中，用 0.1% Triton X-100 进行摇动。第二天，用10 mL的新鲜1X洗涤缓冲液洗两次切片一小时。

在500微升正常抗体稀释剂中稀释原抗体。在37摄氏度下，在稀释的原抗体中轻轻摇动肾片四天。孵育后，在室温下隔夜在10 mL的1X洗涤缓冲液中洗肾片，8小时后更换缓冲液一次。

在500微升正常抗体稀释剂中稀释二级抗体，并在37摄氏度下用肾片孵育四天。请注意，从这一步前进，肾脏切片应受到保护，免受光线。使用二次抗体孵育后，在室温下隔夜用10 mL 1X洗涤缓冲液洗肾片。

要脱水肾片，将其转移到5mL的高档100%乙醇，并在室温下摇动两小时，一小时后刷新乙醇。将肾片浸入两 mL 的乙基辛纳酸酯中，并轻轻摇动过夜。当准备好成像组织时，将600至1000微升乙基辛纳酸酯加入玻璃底盘，并将肾片转移到盘中。

在肾片上放置一个圆形盖滑，用石蜡膜密封盘子。将盘子放在显微镜成像平台上，根据手稿指示对组织进行成像。该协议已用于成功执行肾脏组织的三:D分析，并评估细胞功能和相互作用。

该方法可能导致荧光记者淬火，但其他强荧光蛋白可能抵制信号淬火。腹主动脉扩散可改善抗体扩散。在某些情况下，抗体渗透不良会导致表面信号。

这可以通过更高的浓度或补充抗体来纠正。如果感兴趣的抗原在肾脏血管中表达，应考虑血管内分娩。然而，针对输卵管脱皮细胞的蛋白的抗体不会穿过球状过滤屏障，并导致非特异性信号。

组织可以标记与抗体检测特定的细胞群体或可视化整个管段。此外，通过组合多种抗体，可以实现3D蛋白质的合并。重要的是要记住，抗体标签可以通过良好的肾脏灌注，使用抗原检索步骤，和高抗体浓度得到改善。

一些强报告蛋白可能会抵制此协议后荧光信号的淬火。要对此进行测试，请跳过抗原检索和抗体标记步骤。该技术尊重结构的三维性质，开辟了许多新的研究领域。

它消除了与传统二维分析相关的必需假设和干扰。