用立方体进行全肾三维染色

该协议允许可视化整个肾脏中的三维结构，这可以通过提供宏观视角导致肾脏研究的创新发现。由于抗体穿透困难，整个器官染色具有挑战性。该方案已经证明了抗体对肾脏的高质量、全安装染色。

首先，在灌注固定和肾脏采样后立即进行浸入固定，将肾脏浸入4摄氏度的4%多聚甲醛中16小时。使用 PBS 洗涤三次，每次两小时。通过将固定肾脏浸入7毫米的50%CUBIC-L中，在室温下轻轻摇动来进行脱色和脱脂过程。

六小时后，将肾脏浸入 14 毫米圆底管中的 7 毫升 CUBIC-L 中，在 37 摄氏度下轻轻摇晃五天。每天刷新立方体-L。脱色和脱脂完成后，使用分配勺子处理样品，并在室温下用PBS洗涤肾脏三次，持续两小时。

免疫染色脱脂肾在染色缓冲溶液中稀释的一抗，在37摄氏度的培养箱摇床中轻轻摇动7天。然后，在室温下用PBS（也称为PBST）中的0.5%Triton X-100清洗肾脏一天。对于二抗染色，在染色缓冲液中用二抗在黑暗中治疗肾脏，在37摄氏度下轻轻摇动7天。

在室温下用PBST洗涤液固定染色一天。固定后，将肾脏浸入PB中的1%甲醛中3小时，并在室温下用PBS洗涤6小时。通过将肾脏浸入7毫升50%CUBIC-R +中，在14毫升圆底管中振荡一天，然后用7毫升CUBIC-R +在室温下摇动两天，进行折射率匹配。

在免疫染色方法的帮助下，在3D肾脏成像中可视化整个肾脏中的交感神经和动脉。此外，缺血再灌注损伤后可见异常的肾交感神经。该方案还有助于可视化整个脾脏中的交感神经。

此处显示了三维免疫荧光染色的数据定量过程。此外，在整个肾脏中成功可视化集合导管、近端小管的 S1 段和肾小球。在糖尿病肾病早期阶段给药引起的抑制性肾小球肿大也在3D成像中可视化。

该协议可以标记整个肾脏中的特定分子。因此，研究人员可以分析脉管系统的结构改变或发现肾组织中的罕见事件。