该技术有助于实时观察突触钙活性，作为细胞过程的生理参数，在果蝇黑色素素中基础学习和记忆形成。通过将神经元反应与关联训练之前和之后的气味进行比较，我们可以得出突触活动与单个果蝇记忆痕迹的形成之间的直接相关性。生产转基因果蝇，其中感兴趣的特定神经元表示一个基因编码的钙指标交叉雌性处女和雄性苍蝇携带所需的GAL4和UAS构造，并年龄雌性后代，直到三到六天后，围闭。
要准备苍蝇成像，请使用细钳将冰麻醉苍蝇放入定制准备的成像室。使用解剖显微镜将胸部和腿部与腔室底部的电线接触，头部平躺。用透明胶带固定苍蝇，并使用手术刀刀片切割头部周围的胶带中的窗口，使天线被覆盖，只有胸部前部裸露。
使用凹凸钳口夹住的昆虫针，用蓝光固化胶小心地环绕头部的两侧和背面。并使用蓝色发光 LED 灯来设置胶水。当胶水完全固定时，清除飞头后面的任何残留未硬胶，用一滴林格溶液盖住头部的外露角质层。
使用非常细刀片的刺刀，切开穿过头部后部的角质层，从奥佩利开始，将两侧中切到眼睛，形成角质层皮瓣，使用钳子很容易撕掉。去除任何可能阻塞大脑区域的多余的角质层，并使用细钳小心地清除任何气管的后表面，注意避免脑组织本身的中断。必要时拆下并刷新林格溶液，以清除组织碎屑区域。
放置一个皮下气味输送针，距离苍蝇头部约一厘米，注意没有任何东西可以阻碍气味传递到天线。然后通过皮下气味输送针将成像室连接到气味输送系统。让苍蝇10分钟从麻醉和手术中恢复过来。
要可视化基于 GFP 的钙指标，请将装有红外激光和安装在振动隔离台上的多光子显微镜的激光调谐为 920 纳米的激发波长，并安装 GFP 带通滤波器。使用课程 Z 调整旋钮，扫描大脑的 Z 轴以定位感兴趣的大脑区域。使用裁剪功能将扫描重点放在感兴趣的区域上，以最大限度地减少扫描时间。
旋转扫描视图，使头部前部朝下。然后将帧大小调整为 512 x 512 像素，然后选择要扫描的区域。考虑每个帧的计算扫描时间，实现至少 4 赫兹的帧速率。
对于气味唤起钙瞬态可视化，启动能够连接图像采集软件和气味传递程序的预编程宏封装，并在显微镜软件中开始测量 6.25 秒，以建立 F0 基线值。在气味输送系统中，通过特定气味杯阀的打开和关闭触发的 LED 照明，提供此处指示的 2.5 秒气味刺激。接着是气味偏移结束时的 12.5 秒记录。
然后以相同方式重复第二和第三气味的交付。要在此设置中执行关联调节，请使用计算机控制的气味输送系统，在 12 90 伏电击旁边显示 60 秒的调节刺激加气味。休息60秒后，仅出现60秒的调节刺激-减气味，无电击。
在完成训练阶段后三分钟重复训练前气味刺激方案，测量训练后气味再次引起钙的转性。然后以适当的格式保存映像文件，以进行以后的图像分析。这里具有代表性的蘑菇体输出神经元图像，获得的证明是可以观察到的。
dHomer-GCaMP3 传感器的特定分节表达（在神经元的斧弓室中未表达）显示了树突隔间中的点分信号。与表达细胞酸的苍蝇GCaMP6f相比，在表达dHomer-GCaMp3的苍蝇中可以观察到低振幅气味反应。在这里，单个苍蝇的代表性钙痕迹显示了单个制剂之间可获得的噪声水平和振幅的方差。
这种技术开辟了在亚细胞水平上可视化的可能性，嗅觉表示如何调制，记忆相如何通过调节形成。这些实验对于扩大我们对蘑菇体等复杂大脑结构的理解，以及描述关联记忆如何储存在分散的神经元群体中至关重要。
