使用 Vivo 法戈西西亚赛评估成人嗜血杆菌黑色粒细胞的年龄特异性噬细胞能力

我们的协议提供了一种有效和可重复的方法，用于评估和量化血细胞中的噬菌体事件。这项技术的主要优点是，我们可以量化单个血细胞内的噬菌体事件，这使我们能够检测单个苍蝇基因型中吞噬过程的变化。执行解剖可能具有挑战性，因此首次执行此技术时，在执行完整程序之前尽可能多地练习解剖。

首先准备玻璃针进行注射。将一毫米注射器装满矿物油，并连接与纳米注射器一起提供的 30 量表皮下针。将 30 量针插入拉毛细管针的钝端，并加注矿物油。

慢慢拆下 30 表针，确保没有形成气泡。拆下夹头，将密封的 O 环放置，缩进朝上。将较大的 O 环放在金属柱塞上，然后重新连接夹板而不拧紧。

将金属柱塞插入充满油的玻璃针的钝端，然后轻轻向下推，将其插入更大的 O 环中。然后拧紧胶卷，直到安全。在用荧光或pH敏感颗粒填充针头后，将苍蝇注射到胸骨板中。

如果绿色染料进入苍蝇，注射成功。将注射的苍蝇放入新食物瓶中，记录第一只和最后一只苍蝇被注射的时间。将小瓶放在一边，直到所有的苍蝇都恢复，以防止它们卡在食物中。

在解剖立体显微镜下将苍蝇心室侧定向。然后插入一个昆虫针到胸部和另一个通过腹部最后端靠近生殖器。一旦所有苍蝇被固定，使用转移移液器添加足够的解剖介质来覆盖苍蝇。

用角质剪刀取下头部，在腹部后针正上方做一个水平切口，然后在腹部最前端再切开。做一个垂直切口连接两个水平切口，这将打开腹腔。使用钳子切除内脏和组织，确保避免后体。

如有必要，使用附加销固定角质层的切割端。然后用角质剪刀取下胸毛。丢弃解剖介质，代之以 4%PFA 的毫升，尽可能保护解剖介质免受光线的光。

在室温下固定解剖 15 分钟，同时在 20 rpm 转速下摇动。然后取出固定剂并添加一毫升 1X PBST。如果需要，用抗体染色解剖。

将角质层安装在显微镜幻灯片上后，使用钳子将其腹侧向上定向，并确保后侧容器可见。通过沿后血管对血细胞进行荧光成像，对年轻和年老苍蝇进行特定年龄的吞噬能力进行评估。使用对佩里卡丁的抗体来确保只计算后血管沿线的细胞。

由于荧光标记的大肠杆菌颗粒长度为一微米，血细胞的直径为10微米，因此只计算了以DAPI正核为中心的直径为10微米的荧光事件。然后使用 ImageJ 软件来量化事件。尝试此过程时，重要的是要可视化苍蝇实际上是注射的，并记住计时至关重要。

及时完成注射和解剖将有助于最大限度地减少实验误差和吞噬率的可能变化。这项技术将允许研究人员探索各种研究课题，包括有关细胞免疫、不同血细胞群体或在成功的免疫反应过程中将噬菌体与AMP生产区分的问题。