各种颗粒定量的方法代表了大多数生物学研究的关键方面。该协议允许实时精确定量病毒数据。这种技术取代了传统的病毒数据测量。
通过客观的实时数据，我们低于置信区间，避免了评估劳动密集型终点。该方法可用于诱导细胞病变效应的所有病毒。演示该程序的将是我们实验室的实验室技术人员Quentin Grassin。
为了繁殖和扩增H1N1病毒，根据标准方案在两个75平方厘米的组织培养瓶上接种7.5倍10到6个MDCK细胞，并在37摄氏度下孵育细胞24小时，以达到90%至100%汇合度。第二天，用每个烧瓶每次洗涤五毫升无菌PBS洗涤细胞两次，并将一个烧瓶标记为对照。接下来，在装有新鲜病毒传播培养基的1.5毫升管中将解冻的甲型流感病毒原液小瓶稀释至适当的实验浓度。
使用一毫升稀释的储备液以1倍10至阴性3的多重感染感染感染MDCK细胞，或1倍10至阴性4个斑块形成单位，并向对照瓶中加入一毫升病毒传播培养基。在室温下将病毒吸附到细胞中45分钟，每15分钟搅拌一次。在孵育结束时，取出接种物并用15毫升病毒传播培养基代替，每毫升补充一微克TPCK胰蛋白酶，以促进病毒血凝素HA0切割成HA1和HA2亚基。
然后将烧瓶放入35摄氏度的培养箱中三天。在孵育结束时，在光学显微镜上以40倍物镜比较每个培养物中的细胞，以评估细胞对细胞的细胞病变作用。当细胞病变效应完成时，将细胞培养物上清液加入15毫米管中，并通过离心收集来自每个培养物的细胞碎片。
然后，将澄清的病毒培养物上清液转移到15毫升管中，并将后代病毒等分到一次性无菌低温小瓶中以储存零下80摄氏度。为了确定细胞感染的适当细胞量，在用PBS洗涤细胞之前，在37摄氏度下用3毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA在3毫升中每烧瓶0.25%的孵育45分钟收获它们之前，按照所示制备约80%汇合的MDCK细胞培养物。当细胞分离时，用每个烧瓶7毫升新鲜培养基停止反应，并计数来自每个培养物的细胞。
将细胞稀释至每毫升细胞培养基中第5个细胞的4倍10倍，并按照指示对细胞进行两次连续稀释。将E板在室温下放置几分钟，然后向每个孔中加入100微升细胞培养基，而不接触E板的电极。打开底座，将板前端插入阻抗测量仪的底座口袋。
关闭培养箱门并打开软件。在"默认实验模式设置"中，突出显示选定的底座，然后双击顶部以输入实验的名称。单击布局，然后为板的每个选定孔输入必要的样品信息。
单击计划、步骤和添加步骤。该软件将自动添加一个一秒钟的步骤来测量背景阻抗，单击执行并开始，继续。单击"绘图并添加"以选择适当的孔，确认背景阻抗介于负 0.1 和 0.1 之间，然后再继续下一步。
接下来，从底座中取出板，并将每个细胞悬浮液的100微升一式两份加入适当的孔中。将E板在室温下在层流罩中放置30分钟，以使细胞均匀分布到孔的底部，然后将E板装入摇篮口袋。单击"计划"和"添加步骤"，然后输入值以每 30 分钟监视单元格 200 次重复，然后选择"开始"、"继续"。
要检查和绘制细胞阻抗数据，请单击"绘图"并选择接种后24小时静止期之前的细胞浓度，以获得在病毒感染期间仍处于生长阶段的细胞。为了确定CIT50值与感染多重性之间的相关性，在将3次10至第4个新鲜分裂的MDCK细胞培养到电子微量滴定板的每个孔中24小时后，用每孔100微升新鲜病毒繁殖培养基洗涤细胞两次，每次洗涤，并使用单通道移液管向每个孔中加入100微升病毒悬浮液。当所有病毒稀释液都已加入后，在35摄氏度下轻轻地将板装入仪器的底座口袋中，并开始每15分钟监测一次细胞阻抗，至少100小时，如图所示。
经过两个周期的测量后，单击以暂停设备，然后从底座中取出E板。向每个孔中加入100微升补充有TPCK胰蛋白酶的病毒传播培养基，并将E板放回摇篮口袋中。然后，开始分析。
为了评估甲型流感病毒的生存动力学，在蒸馏水中加入氯化钠至每升35克的终浓度，并将900微升所得盐水溶液加入两毫升冷冻管中。向每个冷冻管中加入100微升病毒储备，并将试管置于35摄氏度的培养箱中，以进行适当的实验时间。在孵育结束的前一天，在16孔微量滴定板中重复步骤，将3倍10至第4个新鲜分裂的MDCK细胞和100微升病毒繁殖培养基的种子重复步骤，允许测量背景阻抗和细胞均匀分布到孔的底部。
然后将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下培养24小时。第二天，洗涤细胞两次，然后用在新鲜培养基中稀释10次的100微升盐水蒸馏病毒感染细胞，并每15分钟监测细胞阻抗至少100小时。在这里，显示了使用不同浓度的MDCK细胞在120小时后获得的原始数据。
24小时后，细胞指数测量显示，接种3倍10至第4个细胞的孔中的细胞仍处于生长的指数阶段，因此，该细胞浓度用于后续实验。MDCK细胞培养物表明CIT50与流感病毒感染的初始多重性之间存在明显的线性关系。典型的生存动力学实验结果表明，由于病毒诱导的细胞病变效应，细胞指数降低。
CIT50可用于计算每种条件下每种病毒的病毒失活斜率，以确定哪种病毒在研究环境中具有最大的稳定性。病毒的稳定性间接地与失活斜率相关，例如，允许鉴定参与甲型流感病毒在宿主外存活的血凝素糖蛋白中的氨基酸残基。这种技术对小的变化非常敏感。
因此，鼓励使用自动细胞计数器，以便在实验之间获得可重复的结果。该方法还可用于比较不同病毒的复制，一次研究多个细胞系的病毒向性，或研究病毒周期的特定步骤。
