蛋白酶降解藻酸盐水凝胶和疏水性微生物反应器，用于猪卵母细胞封装

这种封装猪卵母细胞的协议使得维持COC的球面组织成为可能。这可以防止它们扁平化，并随后破坏卵母细胞和周围卵泡细胞之间的间隙结。描述的两种协议的主要优点是用户友好，并允许有效控制卵母细胞和化疗细胞的生存。

这两种培养系统都是生殖生物学基础研究的宝贵工具，对改善不孕症治疗可能有临床意义。它们还可用于开发新的生物技术方法和改良牲畜。冲洗卵巢后，将它们转移到装满 HM 介质的烧杯中，并在随后的所有操作中将它们存放在 38 摄氏度的培养箱中。

从大型猪卵泡中吸出卵泡液，在室温下以100倍G离心10分钟。然后，使用连接到0.2微米膜孔过滤器的无菌注射器过滤上清液，并在负80摄氏度时将其捕捉冻结。要将 COC 与中等大小的卵泡分离，请将两到三个卵巢转移到充满 HM 的无菌 10 厘米培养皿中。用无菌手术号15刀片轻轻切割突出的卵巢卵泡的表面，这将导致卵泡液和COCs流入培养皿。

用一次性注射器上附着28针吸吸卵泡内装物，并将其转移到另一个培养皿中。要准备IVF培养皿，在中央井中加入一毫升HM，并在外圈中放置三到四滴HM。然后使用聚碳酸酯微管将未损坏的 COC 移动到外圈中的 HM 滴，并短暂冲洗三到四次。

完成后，分别将它们转移到中央井中。将 IVF 板存放在培养箱中。准备血栓和纤维蛋白原解决方案，如文本手稿中所述。

在手术当天，在冰上慢慢解冻纤维蛋白原溶液，并在使用前将纤维蛋白原溶液带到室温。以一比一的比例混合0.5%的藻酸溶液和纤维蛋白原溶液，最终体积为两毫升，轻轻涡旋混合物。在玻璃显微镜幻灯片上涂抹石蜡薄膜薄条，修复孵化室。

将 FA 混合物的移液 7.5 微升滴到带分离隔开的石蜡薄膜涂层玻璃滑轨上，将 8 到 10 滴排列成两排。使用微管将三到五个 COC 转移到 FA 下降的中心，以及最小体积的成熟介质。在每个 FA 滴的顶部添加 7.5 微升的血栓溶液，以覆盖它。

没有必要混合它们，因为凝胶几乎瞬间形成。用先前准备的玻璃滑梯盖住孵化室，然后将培养室倒置，放在一个100毫米的培养皿中，内衬湿润的滤纸。将培养皿放入 5%的二氧化碳中，在 38 摄氏度的培养箱中加热五到七分钟。

孵育后，将每个FA胶囊转移到一个96井板的井中，其中含有100微升的成熟介质。每两天，用新鲜的预平衡成熟介质更换一半的介质。图像 COC 使用 10 倍放大倍率的倒置光学显微镜。

在培养COC四天后，从井中去除成熟介质，并在DMEM中加入100微升，每毫升10个国际单位。将培养盘留在培养箱中 25 至 30 分钟。从溶解胶囊中取出COC。

在DMEM中清洗几次，然后将它们转移到含有PBS的IVF盘内环。在 30 毫米培养皿中制作一张 5 克 FEP 粉末的床。将含有三到五个 COC 的成熟介质液滴到 FEP 粉末上。

以圆周运动轻轻旋转板，确保颗粒完全覆盖液滴表面，形成液体弹珠或LMs。准备几个60毫米IVF培养皿，并在外圈中加入三到四毫升无菌水，以形成湿度室。用 1000 微升移液器拾取成形的 LM，并放入中央井中。

在5%的二氧化碳培养箱中，在38摄氏度的温度下孵化大理石四天。要改变介质，将30微升的成熟介质应用于每个LM，从而导致其扩散。当大理石内容物溶解时，将从生物反应器释放的 COC 转移到培养皿中一滴新鲜成熟介质中。

在成熟介质中洗涤三到四次后，将 COC 以及 30 微升新鲜介质转移到 FEP 粉床上。以圆周运动轻轻旋转板，确保粉末颗粒完全覆盖液体滴的表面，形成新的 LM. 然后，将 LM 转移到 IVF 培养皿中。两种体外成熟系统都产生具有粒状细胞的COC，这些细胞相互紧密粘附，并完整地层层累积细胞。

COC 可行性分析证实，两种封装系统均实现了最佳增长条件。在这两组中，只观察到高生存能力的卵母细胞位点。卵母细胞用透射电子显微镜成像。

线粒体分布均匀，形状为壳状。其中只有少数被拉长，其聚类偶尔被观察到。内质性沉默要么与线粒体相关，要么在卵细胞质中游出。

液体液滴出现为小，暗，圆形结构，和高尔吉仪器出现与扩张的蓄水池。在将 FA 胶囊从孵化室转移到培养板中以及在拾取格式 LM 转移到 IVF 培养皿时，必须精确和小心。