MS2亲和力纯化与革兰阳性细菌中的RNA测序相结合

MS2亲和力纯化与RNA测序或 MAPS 相结合，已开发出来，以识别任何对细菌感兴趣的 RNA 的整个靶点。这项技术使得能够独立于监管机制识别任何类型的 sRNA 合作伙伴。依赖sRNA的监管网络的定性将有助于更好地了解宿主细胞内细菌的毒性因素产生、生物膜形成和生存，并最终对抗葡萄球菌感染。

此协议可应用于任何致病性或非致病性克阳性细菌。展示这个程序的将是来自帕斯卡尔·隆比博士实验室的博士生诺米·默西尔。首先，在三毫升的BHI介质中生长一组携带pCN51 P3 MS2 sRNA或pCN51 P3 MS2质粒的菌株，并辅以重复中每微升红霉素10微克。

将每个隔夜培养在 50 毫升的新鲜 BHI 介质中稀释，辅以红霉素，达到 0.05 的 OD 600。在 37 摄氏度下培养文化，在 180 RPM 下摇晃 6 小时。将每个培养物转移到一个50毫升的离心管中，在4摄氏度下将管子在2900倍G下离心15分钟，然后丢弃超自然物，在零下80摄氏度下冷冻和储存，或将颗粒留在冰上，直接进行机械细胞裂解。

为了进行机械细胞裂解，在5毫升缓冲A中补充颗粒，并将再发射的细胞转移到15毫升离心管，并带有3.5克二氧化硅珠。将管子插入机械单元溶解仪器中，以每秒四米的速度运行 40 秒的循环。将管子在2，900倍G中离心15分钟，然后恢复超母，并将其保持在冰上。

确保超自然是明确的，重复离心，如果不是。取出柱尖，然后将色谱柱放入柱架中，用超纯水清洗柱子。加入300微升淀粉样酶树脂，用10毫升缓冲剂A.Dilute 1，200皮卡莫莱MBP-MS2蛋白在6毫升的缓冲A中清洗柱子，并加载到柱中。

用 10 毫升缓冲器 A.下一步清洗柱子，执行 MS2 亲和力纯化。将细胞解体加载到柱中，并在干净的收集管中收集流过的分数。用 10 毫升缓冲器 A 清洗柱子三次，收集洗涤分数，然后用一毫升缓冲 E 将柱子稀释，并在两毫升微管中收集洗涤分数。

将所有收集的分数保留在冰上，直到RNA提取。使用每个分数的一毫升进行RNA提取。在RNA中加入一卷酚，然后大力混合，然后在20摄氏度下将混合物在16，000倍G中分离10分钟。

将上一阶段转移到一个干净的两毫升微管。加入一卷氯仿异酰醇，重复离心，然后将上相转移到新管中。在pH 5.2时加入2.5卷100%冷乙醇和0.1卷三摩尔醋酸钠，在零下20摄氏度下过夜沉淀。

第二天，离心机管在16，000倍G和4摄氏度下15分钟。用移液器慢慢去除乙醇，注意不要干扰颗粒。加入500微升80%的冷乙醇和离心机5分钟。

通过缓慢管道丢弃乙醇，然后使用真空浓缩器在运行模式下干燥颗粒五分钟。将颗粒在适量的超纯水中补充。此协议用于研究 S.aureus 中的 RsaC 目标。

使用 MAPS 技术识别了几个直接与 RsaC 相互作用的 mRNA，揭示了其在氧化应激和金属相关反应中的关键作用。为了确认MS2 sRNA的构造并可视化其表达模式，细胞在BHI介质中经过2、4和6个小时的生长后被收获。提取了RNA，并使用 RsaC 特定的 DIG 探测器进行了北污点分析。

内源性 RsaC 水平在生长 6 小时后显著增加。重要的是，MS2-RsaC 544 和 MS2-RsaC 1，116 的水平可与 6 小时内的内源 RsaC 相媲美。进行了亲和力纯化，从野生型菌株中的粗提取物、流经和洗脱分数中提取RNA，仅表达 MS2 标签和表达 MS2-RsaC 544 构造的突变 RsaC 菌株。

1，116核苷酸长内源性RSAC在回流部分被丰富，但由于其长度和复杂的次要结构，它与亲和力柱非具体地相互作用。MS2-RsaC 544在浓缩部分高度浓缩，表明它被MS2-MBP融合蛋白成功保留。生物信息学分析显示，根据MS2 sRNA和MS2控制之间的折叠变化，假定mRNA目标，表明草药是第一个假定目标。

在 MS2 亲和力纯化后，对北方污点进行了针对 SODA 的 DIG 探头分析，结果表明，与 MS2 控制相比，sodA 与 MS2-RsaC 544 有效共丰富。在尝试此协议时，请记住，添加 MS2 标签会影响 sRNA 确认、稳定性或功能。这一点应仔细监测。

地图提供了 sRNA-RNA 目标配对的快照。进一步的实验验证将解开它们的功能。该技术是构建任何细菌 sRNA 监管网络的强大工具。