我们希望创建一个中风模型，该模型产生与患者样本相似的血凝块，并对临床相关的溶栓治疗做出反应。因此，我们修改了经典的光血栓中风模型，并在光活化之前混合凝血酶和光动力染料孟加拉玫瑰。我们很高兴该手术确实会产生对tPA介导的溶栓高度敏感的血凝块。
这种改良的光血栓中风模型使用非常简单的外科手术，死亡率低，产生了高度一致的梗死大小和位置。您还会产生纤维蛋白和血小板混合血凝块，与急性卒中患者的血凝块相似。因此，我们认为开发更有效的溶栓疗法对于临床前卒中研究非常有用。
我们希望更多的人使用我们的模型。演示该程序的将是我们的研究助理教授Yu-Yo Sun博士。手术前30分钟，通过注射镇痛剂来准备小鼠。
麻醉鼠标后，捏住脚趾以确保其完全麻醉。然后用脱毛膏去除左脖子和头部的毛发。将鼠标放在仰卧位的小动物适配器上，并用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次，对手术皮肤区域进行消毒。
在解剖显微镜下，使用一把微型剪刀和直镊子在中线外侧约 0.2 厘米处做一个 0.5 厘米的左侧颈椎切口。接下来，使用一对细锯齿镊子，拉开软组织和筋膜，露出LCCA。然后使用一把细光滑的镊子，小心地将LCCA与迷走神经分开。
使用 5-0 丝线缝合线在 LCCA 周围放置永久性双结缝合线。将鼠标翻转到俯卧位，然后将鼻夹滚动 15 度。然后用三滴Betadine和70%乙醇交替擦拭皮肤，对手术区域进行消毒。
用一把微型剪刀和直镊子沿着左眼和耳朵在头皮上做一个0.8厘米的切口，露出颞肌。接下来，沿着左顶骨颞肌边缘做一个 0.5 厘米的切口。然后在颞肌上做第二个0.3厘米的垂直切口，并缩回肌肉，露出顶骨和鳞状骨的边缘。
确保可视化额骨和顶骨之间的冠状缝合线的里程碑。接下来，通过应用无菌生理盐水润湿颅骨以显示左侧MCA，并用记号笔在鳞状骨上标记近端MCA分支。用气动牙钻轻轻地在这个标记区域周围画一个直径为一毫米的圆圈。
然后将头骨变薄约0.2毫米深，而不接触硬脑膜下方。当残留一层非常薄的骨头时停止钻孔。接下来，根据小鼠的体重混合凝血酶和玫瑰孟加拉溶液，并用 31 号针将混合物缓慢注入眶后窦。
在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。用 532 纳米激光将照明器施加在两英寸距离内的钻孔部位 20 分钟。通过激光投影护目镜可视化 MCA 近端分支的照明。
20 分钟后，停止激光照明。在颅骨的顶骨上做一个直径为三毫米的颅窗，并在上面放置一个盖玻片。然后在 20 倍水浸物镜下定位远端 MCA。
在成像前五分钟通过尾静脉注射 DyLight 488 偶联的抗 GP1b-β 抗体标记循环血小板。然后眼眶后注射凝血酶和玫瑰孟加拉溶液混合物。使用直径为 10 微米的激光束的 532 纳米激光系统光激活 MCA，并记录图像直至血栓形成。
对于tPA给药，将麻醉的动物放在37摄氏度的温暖垫上。在选定的光激活后时间点用 45 摄氏度的温湿纱布包裹它的尾巴一分钟。接下来，通过尾静脉注射重组人tPA。
推注 50%，然后使用输液泵在 30 分钟内输注剩余的 50%。为了监测脑血流，在头皮上做一个中线切口，露出头骨。用无菌生理盐水润湿颅骨，然后轻轻地将超声波凝胶涂抹在颅骨上，确保避免凝胶中出现毛发或气泡。
在激光散斑对比成像仪下监测两个大脑半球的脑血流 10 分钟。免疫荧光标记显示，在基于孟加拉玫瑰染料的光血栓形成中，MCA分支密集地填充了CD41阳性血小板和少量纤维蛋白。相反，在凝血酶加孟加拉玫瑰光血栓形成中，MCA分支被随机混合的血小板和纤维蛋白凝块阻塞。
免疫印迹分析显示，与单独使用孟加拉玫瑰相比，凝血酶加孟加拉玫瑰光血栓形成的同侧半球纤维蛋白沉积增加两倍以上。基于共聚焦显微镜的活体成像显示，即使在激光照射下，静脉注射凝血酶也未能诱导血小板聚集。在孟加拉玫瑰光血栓形成模型中，血小板形成均匀的凝块，但在凝血酶加孟加拉玫瑰模型中，血小板聚集不均匀，有多个微弱区域。
通过激光散斑对比成像测量同一只小鼠在 tPA 治疗前和后 24 小时与载体治疗的 CBF，并归一化到对侧半球。在孟加拉玫瑰光血栓形成中，tPA治疗导致CBF恢复的趋势，特别是在缺血性边界区域，与载体治疗的小鼠相比。在凝血酶加孟加拉玫瑰光血栓形成中，tPA处理小鼠CBF的恢复更为突出，近端MCA分支常在24小时可见。
在孟加拉玫瑰光血栓形成中，在载体处理和tPA处理的小鼠中检测到相似的梗死大小。相比之下，在凝血酶加孟加拉玫瑰光血栓形成中，与载体治疗的小鼠相比，tPA 裂解治疗在光激活后 0.5、1 或 2 小时显着减少了梗死，但在光激活后 6 小时内没有，凝血酶介导的纤维蛋白生成对于该过程中的血栓形成至关重要。该方法可用于研究凝块组成并进一步研究溶栓治疗。
在此程序之后，可以应用其他溶栓治疗方法并确定后期疗效。添加凝血酶可以将凝块组成从纤维蛋白贫乏调整为纤维蛋白富集，使研究人员能够制定临床相关的治疗策略。
