该协议描述了一种涂层方法，使用轨道摇床模型将内皮细胞生长限制在 6 井板的特定区域，用于纯粹的应力应用。研究流对内皮的影响的一个常见方法是在轨道摇床的多井培养板中培养内皮细胞。轨道摇床会发出围绕油井旋转的波浪。
井中心的细胞经历被认为会导致动脉粥样硬化的流动。靠近边缘体验流的细胞被认为是保护性的。每个区域的细胞属性假定取决于它们所经历的纯压力。
然而，这种逻辑中存在潜在的底层。内皮细胞以依赖于流量的方式释放调解员。这些调解员将在旋转介质中达到均匀的浓度，因此将影响释放细胞以外的区域的细胞。
这可能损坏或隐藏剪切对细胞行为的真正影响。效果不仅限于旋转井系统。它甚至可能发生在简单的模型中，如平行板流室。
它可以通过在系统中仅有一部分中生长细胞来避免。在这里，我们描述的方法，允许细胞粘附只在中心或仅在漩涡井的边缘。制造不锈钢模块。
根据提供的工程图纸，从 316 级不锈钢中制造不锈钢模块。PDM 上的 3D 打印。 根据提供的工程图纸，使用 SOLIDWORKS 编写 PDM 模具的 3D CAD 模型。
将 CAD 模型导入 STL 文件，并将 STL 文件导入 Cura 2.6.2。将模型切成每秒 50 毫米的打印速度和 60% 的填充密度的层，将文件作为 GCode 导出。将其上传到乌尔蒂制造商 3D 打印机进行打印。
使用聚乳酸作为印刷材料。PDMS 环的铸造。将 PDMS 碱基和固化剂与 90.9% 碱基和 9.1% 固化剂的比例很好地混合。
将混合良好的溶液倒入 3D 打印模具中。去除真空脱气室中的气泡。在80度的炉子里治疗一小时。
允许 PDMS 环冷却到室温。然后小心地从模具中取出固化的 PDMS 环。准备1%普鲁罗尼奇F-127。
重量为五克普鲁罗尼奇F-127。倒入玻璃瓶中。然后在玻璃瓶中加入一百万米米水。
这提供了 5% 的普鲁罗尼奇 F-127 解决方案。确保所有普鲁罗尼奇F-127粉末都浸入水中。关闭盖子，使用液体灭菌循环程序将其高压灭菌。
使用前让溶液冷却到室温。将 10 密耳的 5% 普鲁尼克 F-127 解决方案添加到 40 万毫计的高压米利-Q 水中，使 1% 的普鲁尼克 F-127 解决方案。在生物安全柜罩中进行稀释。
在室温下存放 1% 和 5% 的普鲁罗尼奇 F-127。涂层6井板。使用前，自动结块不锈钢模块、PDMS 环和钳子。
在 BSC 罩中执行所有后续程序，并观察无菌技术以确保无菌。使用钳子将 PDMS 环放在 6 井中。使用 PDMS 环的外部边缘在井内同心对齐 PDMS 环。
请注意，应仅使用非组织培养处理良好的板材。使用钳子将不锈钢模块放在 PDMS 环的顶部。将内部保留环钳的尖端插入保留环的握把中。
挤压支架以降低固定环的直径。将其放入 6 井中，将其牢牢压在不锈钢模块上，并释放钳子，以确保井中的 PDMS 环的安全。通过打开 PDMS 环和不锈钢模块，将每微升纤维素的 1 密耳（5 微克）添加到井的中心或边缘，具体取决于感兴趣的区域。
旋转板，以确保纤维素溶液覆盖所有感兴趣的区域。在 95% 空气和 5% CO2 下的加湿孵化器中，在 37 度下孵化 30 分钟。从井中取出纤维素溶液。
现在用 Pbs 洗两次。完成后，从井中完全取出 PBS。从井中取出固定环、不锈钢模块和 PDMS 环。
将1.5万的1%普鲁尼奇F-127加入井中，在室温下孵育一小时，以使未涂布的表面通电。从井中取出普鲁罗尼奇 F-127 溶液，用 PBS 清洗三次。洗净后，立即使用涂层井或在四度储存长达两周的时间，涂层井中带有 PBS 层。
内皮细胞的播种。使用血细胞计和种子18万细胞在1.5万预热细胞培养介质中将细胞计数成涂层的6井板。横向摇动井板，确保细胞均匀地分布在井中。
将其留在 37 度加湿的孵化器中，在 95% 空气和 5% CO2 下过夜。使用轨道摇床剪切应力应用。细胞在生长三天后应达到汇合。
用 190 万的预警细胞培养介质替换介质，达到两毫米的高度。将一个井板放在一个潮湿的孵化器的轨道摇床平台上，在150 RPM旋转三天。可选的，经过两天的剪切，细胞因子可以添加到细胞培养介质，以调查细胞因子和纯粹的压力之间的相互作用。
治疗后，再切细胞一天。在这项研究中，TNF-阿尔法被用来激活细胞。在三天的剪切应力应用后进行分析。
显微镜图像显示，普鲁罗尼奇F-127防止HUVEC粘附到该地区没有纤维素涂层。在生长图A和图C中，在24小时后，在普鲁罗尼克F-127失活之前未预处理过纤维素的井面部分没有附加HUVEC。没有普鲁罗尼奇F-127的通过，HUVEC被连接到表面没有纤维素，24小时后播种，在图B，并进一步增殖72小时，在图D.比例杆等于500微米。
核红污渍显示切变的HUVEC，A，在中心和B的形态，在一个完整的井的边缘。秤杆等于一百微米。A 和 B 还显示通过 ZO-1 免疫维护划出的细胞轮廓。
注意边缘细胞的排列和拉长，而不是中心。它显示核形状指数（表示圆形）在全井生长的 HUVEC 和未经处理或 TNF-阿尔法处理的 HUVEC 的细分井之间没有显著差异。细胞在井边拉长得更长。
在TNF-阿尔法处理的HUVEC中，更延长的倾向在各地并不一贯显著。在不同径向位置，未处理的 A、未经处理的全井和分段井密度为 B、TNF-阿尔法处理的 HUVEC 之间没有显著差异。在这两种情况下，每个单位区域在边缘的细胞都比在井中央的细胞多。
总之，我们在这里概述的方法允许您在任何基于塑料的细胞培养系统中，仅在旋转井的一个区域或实际上生长细胞。这意味着，经历一种流的油井一部分的细胞不受从经历不同流动的另一个区域的细胞释放的介质的影响。不仅如此，我们可以观察在一个区域生长的细胞，无论是否在其他区域生长细胞。
这可以证明这种可溶性调解人的影响。测试条件介质对天真细胞的影响允许同样的事情。通过分析条件介质，可以识别调解员。
