缺氧是癌症发展的关键驱动因素，诱发基因组不稳定和肿瘤形成。我们演示了基于 3D 生物打印技术的体外固体癌症中产生中央缺氧的方法。使用这种方法，可以使用简单的策略复制无线电低氧梯度，该策略结合了 3D 打印气体透气屏障和玻璃盖。
这种缺氧癌症片上技术可用于预测药物疗效，以方便患者特定的抗癌药物处方。而且，它也有望使侵略性癌症的快速诊断。为了帮助制备三毫升中和胶原蛋白预凝胶溶液，将 30 毫克胶原蛋白海绵切成 5 x 5 毫米平方块。
将碎片放入无菌的 10 毫升玻璃瓶中，在小瓶中加入 2.4 毫升 0.2 微米注射器过滤器 0.1 普通盐酸，在摄氏 4 度和每分钟 15 圈的三天孵化中。消化后，通过40微米细胞过滤器应变任何未消化的胶原蛋白颗粒，并将酸性胶原蛋白溶液储存在4摄氏度，持续7天。要调整 1%中和胶原蛋白预凝胶溶液的 pH， 在混合和离心后，将 30 微升酚红色溶液添加到最终浓度为 1%和 300 微升的 10X PBS 中，最终浓度为 10%，使用一种普通氢氧化钠将 pH 值中和到 7，验证颜色变化并加入蒸馏水，获得总容量为 3 毫升。
然后将 pH 调整后的 1% 中和胶原蛋白预凝胶溶液存放在 4 摄氏度，在三天内使用。要预先检查中和胶原蛋白预凝胶溶液的凝胶，请使用正位移移液化剂将 50 微升胶原蛋白液滴添加到小菜中，并在 37 摄氏度的孵化器中孵化液滴一小时。在孵化结束时，检查胶原蛋白是否从透明颜色变为不透明的白色。
倾斜容器以确认胶原蛋白粘附在容器底部。并将 PBS 倒入液滴，以确认胶原蛋白构造不会破坏溶液。有关牺牲的 PEVA 模具的 3D 打印，请单击"文件"并保存文件类型为 STL，将 3D CAD 文件转换为 STL 文件，然后单击选项和输出表单作为 ASCII 生成 G 代码。
要导入生成的 STL 文件，请单击"文件"并打开 STL 文件并选择已保存的 STL 文件。要自动生成牺牲的 PEVA 模具的 G 代码，请选择 STL-CAD 交换器的切片模型。然后，要生成芯片制造的打印路径，请在 110 摄氏度的 500 千帕气压下使用 50 度精确喷嘴，将牺牲的 PEVA 模具打印到无菌粘合亲水组织学幻灯片上。
为了铸就 PDMS 屏障，在塑料储液池中混合 6 毫升 PDMS 碱基弹性体和 600 微升固化剂 5 分钟，并将均匀混合溶液加载到 10 毫升一次性注射器中。为注射器配备 20 仪表塑料锥形分配尖端，并使用混合 PDMS 解决方案填充牺牲的 PEVA 模具。混合的 PDMS 将用凸面填充此牺牲的 PEVA 模具，屏障将高于模具。
在 40 摄氏度烤箱中固化 PDMS 屏障超过 36 小时后，为避免 PEVA 熔化，使用一对精密钳子分离牺牲的 PEVA 模具，并在高压灭菌器中在 120 摄氏度处对气体透气屏障进行消毒。要将溶液与癌细胞混合，在 20 微升培养介质中再吸收每种类型的收集细胞颗粒，并在湿冰上每个恢复的细胞悬浮液中加入 1%中和胶原蛋白预凝胶溶液，然后轻轻混合。使用正位移移移器混合每个单元格悬架。
获得同质解决方案后，使用正一次性移液器将细胞封装胶原蛋白生物因子转移到单个三毫升一次性注射器中，并将注射器储存在摄氏四度，直到 3D 细胞打印。对于癌症-频闪同心环的 3D 打印，将适当的 3D CAD 文件转换为 STL 文件格式，并使用 STL-CAD 交换器生成癌症频闪同心环的 G 代码。将细胞封装胶原蛋白放入 3D 打印机头，并将头部和板材的温度设置为 15 摄氏度。
在 3D 打印机的控制软件上加载生成的打印路径，然后单击"开始"，根据加载的 G 码将胶原蛋白生物因子打印到气体渗透屏障上，该 G 码带有 18 个仪表塑料针，气压约为 20 千帕，温度约为 15 摄氏度。每次打印操作结束时，手动在气体透气屏障顶部放置消毒的 22 x 50 毫米玻璃盖，以产生低氧梯度。在产生三个缺氧癌后，芯片转移到37摄氏度的孵化器一个小时，将胶原蛋白生物素交叉连接。
当所有低氧癌片都打印出来后，用细胞刮刀轻轻擦过气体透气屏障顶部的盖眼镜，以紧密结合。为了在不分离癌症构造的情况下将细胞培养介质刷新到芯片上，将芯片倾斜，并使用移液器将 1.5 毫升内皮细胞生长介质引入每个芯片的侧面。芯片上的缺氧癌以同心环的形式设计，以模拟癌症组织中观察到的径向氧扩散和耗竭。
在确定供氧和细胞消耗的空间的控制体积后，可以通过计算有限元素分析确定中央缺氧生成的适当细胞密度。在3D细胞打印后，可以创建一个分隔的癌症-频闪同心环结构，以再现实体癌症的解剖特征。从数量上讲，打印后细胞的生存能力通常大于 96%，这证实了制造条件适合癌症和频闪细胞。
在这个具有代表性的分析中，根据氧气梯度的存在和缺失对两组进行了比较，以验证缺氧梯度对癌症进展的影响。在这两种条件下，外围区域都存在成熟的CD31正内皮细胞，表明空间模式的活体结构是利用3D生物打印技术产生的。与氧梯度负条件相比，梯度阳性状况表现出低氧梯度，表示HIF1α的逐渐表达。
还观察到SHMT2阳性伪帕利塞德细胞和SIX2阳性多能细胞，表明固体癌症具有侵略性病理生理特征。芯片上的缺氧癌是研究实体癌症病理生理特征和癌细胞与肿瘤形成促进微环境的动态相声的有用工具。由于该方法可在合理的时间范围内适用于患者特定药物设计，因此该方法有望弥合体内和体外癌症模型之间的差距。
