大家好。我叫尼古拉斯·温我是俄亥俄州哥伦布市全国儿童医院的首席调查员。
今天，我们将向您展示一个视频，讲述如何进行皮肤活检，并将其转换为肌细胞和肌管。这是研究神经肌肉疾病的非常有用的工具。此外，与IPSC相比，这是一种更快的技术，因为我们使用两种不同类型的病毒来直接对抗这种类型的细胞。
此视频演示了建立人类皮肤衍生成纤维细胞培养物、转换为肌细胞，然后区分肌管的协议。皮肤活检转移到细胞培养，以获得皮肤成纤维细胞。携带 hTERT 和 MYOD 基因的伦蒂病毒用于转导这些成纤维细胞。
在添加以多西环素补充的肌细胞生长介质后，MYOD基因被表达出来，诱导成纤维细胞转化为肌细胞。接下来，介质切换到分化介质，也辅以多氧环素。然后肌细胞相互融合，形成多核肌管。
从管子中吸出介质，用10毫升冲洗活检，室温下1 x PBS，3次。第三次洗涤后，将 PBS 留在管子中。将 PBS 和皮肤活检倒入 10 厘米平方的盘子中。
使用无菌手术刀，将活检切成尽可能小的碎片。使用移液器，将单个皮肤片转移到无菌的 10 厘米方形盘上。从每一块周围吸出多余的 PBS 。
小心不要把那块自己吸起来。用盖子部分盖住盘子，让皮肤活检件干燥5至20分钟。不要让碎片干燥太久。
一旦片件干燥，倾斜45度角的菜，慢慢添加12毫升的成纤维细胞介质到菜的角落。放下盘子，小心地分发媒体，这样碎片就不会被媒体举起来。将菜肴放入孵化器。
在五到七天内更换媒体，之后每周更换一次。种子原成纤维细胞在30%的汇合和两口井的12井板，约2万细胞每口井，以便有约50%的汇合第二天。对于扁豆病毒转导，添加20亿到50亿个hTERP普洛霉素伦蒂病毒的病毒基因组和400个成纤维细胞介质的微升。
将扁豆病毒混合到一口井中。到第二口井，只需添加400微升的成纤维细胞介质。第二天，添加一毫升的介质。
一两天后，将细胞转移到六井板中，并将其生长到60%至70%。以每毫升一微克的普洛霉素补充成纤维细胞介质，并在每口井中添加两毫升。保持细胞的选择，直到所有细胞在控制井死亡至少12天，改变媒体每两到三天。
H号种子图表示成纤维细胞在12个井板的三口井的30%汇合，第二天有大约50%的汇合。对于扁豆病毒转导，混合20亿至50亿个MYOD Hygromycin B扁豆病毒的病毒基因组和400微升成纤维细胞介质，并添加到两口井。第二天加一毫升中等。
一两天后，将细胞转移到六井板中，并生长到60%至70%的汇合。补充生长介质，每毫升400微克的催眠素B.在每个井中添加两毫升。将细胞进行选择，直到控制井中的所有细胞都死亡，通常至少需要 12 天，每两到三天更换一次介质。
对于肌细胞的诱导，生长成纤维细胞，直到它们70%的融合。将每毫升多西环素添加8微克到肌细胞生长介质中。始终使用杜西环素和介质的新鲜方位。
媒体应在任何媒体变化之前立即准备。此外，多氧环素不应被重新冻结。吸气成纤维细胞介质，用PBS冲洗细胞。
添加10毫升补充肌细胞介质。两到三天后，细胞是90%到95%的汇合体，它们的形态会发生变化。吸气肌细胞生长介质，用PBS冲洗细胞表面。
添加10毫升的分化介质，补充每毫升8微克的新鲜多西环素。继续每两三天更换一次媒体，直到形成肌管。在肌管分化启动7至10天后，细胞应完全分化，但这因细胞线而异。
第一批成纤维细胞可能在皮肤碎片形成五天后出现。在图片B中，成纤维细胞是汇合的，并准备转移到75厘米见方的烧瓶进一步扩散。当原始细胞进入复制性衰老时，在低通道数下冻结几瓶成纤维细胞是很重要的。
一旦FM细胞系被确定为将成纤维细胞转换成肌管，成纤维细胞必须扩散到图片A所示的70%的融合。在将多西环素加入介质后，在两到四天内，细胞就变成了肌细胞体，其特征是图B中所示的拉长形态和平行方向。在分离之前，必须收集或修复这些细胞。
正如此图片中的箭头指出的，可以通过肌管边缘的颜色和亮度来观察分离的开始。通过免疫荧光，成熟肌肉特异性蛋白质的表达证实了成纤维细胞成功转化为肌管。在这些图片中，显示了三个不同的细胞。
分化程度因细胞而异，原发性突变可能或可能不会影响，因为图 B 和 C 中的细胞情况。如图所示，与骨骼肌相比，在调频肌管中检测到的基因有12，000多个不同表达的基因。两个转录体之间的显著相关性支持调频细胞具有肌肉特定的表达轮廓，表明它们是肌肉衍生细胞系的有用和可靠的替代体。
为了说明这种体外模型的有用性，我们使用了DMD基因中最常见的外在复制之一。Exon 二的复制会导致 DMD 读取帧的中断，其跳过可导致该读取帧的恢复或内部核糖体入口站点的利用。这种疗法已经验证与体内研究图A，我们证明了概念证明，通过RTPCR分析这种特殊的变异细胞线，有和没有治疗的exon跳过。
图B中的西方污点表明功能性萎缩蛋白在经过处理的细胞中表达。当将这种疗法的效率与体内模型进行比较时，结果支持细胞分化技术的可靠性，并支持其用于测试各种突变特定基因疗法。在临床研究之前，需要测试官方治疗支持神经肌肉疾病的疗效，这取决于动物和细胞模型的能力。
动物模型的发展，虽然现在更容易，它不是一个可行的选择，为每一个特定的突变。通过从皮肤成纤维细胞中提取的IPS细胞生成肌细胞是一种替代技术，但它是一种耗时的技术。因此，此过程是 IPS 生成的简单替代方案，允许将成纤维细胞直接转换为肌细胞。
它通过避免肌肉活检的侵入性更强的应用来促进人类细胞模型的获取。 总之，这种将成纤维细胞直接转化为肌细胞是测试限制特定环境中神经肌肉疾病疗法的有力工具。
