みなさん。私の名前はニコラス・ウィーンです。私はオハイオ州コロンバスの全国小児病院の主任研究者です。
そして今日、私たちはあなたに皮膚生検を取り、筋芽細胞と筋管に変換する方法についてのビデオを紹介するつもりです。これは神経筋障害を研究するための非常に有用なツールです。さらに、このタイプの細胞と直接戦うために2種類のウイルスを使用しているため、IPSCと比較して技術が高速化されます。
このビデオは、ヒト皮膚由来線維芽細胞培養物、筋芽細胞への転換、および分化された筋管を確立するためのプロトコルを示す。皮膚生検は、皮膚線維芽細胞を導出するために細胞培養物に移される。hTERTおよびMYOD遺伝子を運ぶレンチウイルスは、これらの線維芽細胞をトランスデュースするために使用される。
ドキシサイクリンを添加した筋芽細胞増殖培地を添加すると、MYOD遺伝子が発現し、線維芽細胞の重芽細胞の重芽への変換を誘導する。次に、培地を分化培地に切り替え、またドキシサイクリンを添加する。その後、筋芽細胞は互いに融合し、多核筋管を形成する。
チューブから培地を吸引し、生検を10ミリリットル、室温で1xPBS、3回洗いすす。3回目の洗浄後、PBSをチューブに残します。PBSと皮膚生検を10センチメートルの正方形の皿に注ぎます。
無菌メスを使用して、生検をできるだけ小さく切ります。ピペットを使用して、個々のスキンピースを無菌10センチメートルの正方形の皿に移します。各部分の周りからPBSの過剰を吸引します。
作品自体を吸引しないように注意してください。蓋を部分的に蓋で覆い、皮膚生検片を5〜20分間乾燥させます。作品が長く乾かないようにしてください。
片が乾燥したら、皿を45度の角度で傾け、皿の隅に12ミリリットルの線維芽細胞培地をゆっくりと加えます。皿を下ろし、慎重にメディアを配布して、メディアによって破片が持ち上げられないようにします。食器をインキュベーターに入れる。
5~7日でメディアを交換し、その後週に1回交換してください。翌日の12ウェルプレートの30%と12ウェルプレートの2つのウェルで一次線維芽細胞をシードし、1ウェルあたり約20,000個の細胞を有する。レンチウイルス伝達の場合、hTERP プロマイシン レンチウイルスの 20 億から 50 億のウイルスゲノムと線維芽細胞培地の 400 マイクロリットルを追加します。
レンチウイルスミックスを1つの井戸に加えます。第二の井戸に、線維芽細胞培地のわずか400マイクロリットルを追加します。翌日、1ミリリットルのメディアを追加します。
1〜2日後、細胞を6つのウェルプレートに移し、60〜70%の合流に達するまで増殖させる。プロマイシンのミリリットルあたり1マイクログラムで線維芽細胞培地を補い、各井戸に2ミリリットルを加えます。コントロールウェル内のすべてのセルが少なくとも12日間死んでしまい、2~3日ごとにメディアが変化するまで、セルを選択したままにします。
12ウェルプレートの3つのウェルで30%合流で線維芽細胞を発現するシードHチャートは、翌日に約50%の合流を有する。レンチウイルス伝達の場合、MYODハイグロマイシンBレンチウイルスの2〜50億個のウイルスゲノムと400マイクロリットルの線維芽細胞培地を混合し、2つの井戸に加える。翌日に1ミリリットルの培地を加えます。
1〜2日後に細胞を6つのウェルプレートに移し、60〜70%コンフルエントまで成長させる。ハイグロマイシン B のミリリットルあたり 400 マイクログラムを含むサプリメントの成長培地.コントロールウェル内のすべての細胞が死ぬまで細胞を選択し、通常は少なくとも12日かけて、2〜3日ごとに培地を変更します。
筋芽細胞の誘導のために、彼らは70%コンフルエントになるまで線維芽細胞を成長させます。ミオシルト成長培地にドキシサイクリンのミリリットル当たり8マイクログラムを追加します。.常にドキシサイクリンと培地の新鮮なアリコートを使用してください。
メディアは、メディアが変更される直前に準備する必要があります。さらに、ドキシサイクリンは再凍結してはならない。線維芽細胞培地を吸引し、PBSで細胞をすすいだ。
補充された筋芽細胞培地の10ミリリットルを追加します。2〜3日後、細胞は90〜95%コンフルエントであり、その形態は変化している。筋芽細胞増殖培地を吸引し、細胞表面をPBSですすいだ。
新鮮なドキシサイクリンのミリリットルあたり8マイクログラムで補われた分化培地の10ミリリットルを追加します。.myotube が形成されるまで、2~3 日ごとにメディアを変更し続けます。myotube 分化の開始から 7 ~ 10 日、細胞は完全に分化する必要がありますが、これは細胞株によって異なります。
最初の線維芽細胞は、皮膚片が培養された5日後に出現する可能性がある。図Bでは、線維芽細胞はコンフルエントであり、さらなる増殖のために75センチメートルの正方形フラスコに移される準備ができている。原発細胞が複製老化に入るにつれて、低い通過数で線維芽細胞のいくつかのバイアルを凍結することが重要です。
筋芽細胞のミオチューブへの変換のためにFM細胞株が確立されると、線維芽細胞は、A図に示すように70%コンフルエントまで増殖しなければならない。ドキシサイクリンを培地に添加した後、2〜4日以内に細胞は、画像B.分化筋管に見られるように細長い形態と平行配向によって特徴付けられる筋芽細胞となり、画像Cに示されている。セルは、デタッチする前に収集または固定する必要があります。
剥離の始まりは、この写真の矢印で指摘されているように、myotubeの縁の色と明るさによって観察することができます。免疫蛍光によって、成熟した筋肉特異的タンパク質の発現は、線維芽細胞の筋管への正常な変換を確認する。これらの写真では、3つの異なるセルが示されています。
分化の程度は細胞によって異なり、図BおよびC.RnAseqによってさらに検証されたモデルの細胞の場合、一次突然変異によって影響を受けるかもしれないし、影響しない場合もある。このプロットに示すように、FM筋で検出された12,000以上の微分発現遺伝子は骨格筋の遺伝子と比較してある。両方のトランスクリプトムの有意な相関関係は、FM細胞が筋肉由来細胞株の有用で信頼性の高いサロゲートであることを示す筋肉特異的発現プロファイルを有することを支持する。
このin vitroモデルの有用性を説明するために、DMD遺伝子の中で最も一般的なエキソン重複の1つを使用しました。Exon 2の重複はDMDの読書フレームの中断につながり、そのスキップは、その読み取りフレームの復元または内部リボソームエントリサイトの利用につながる可能性があります。この治療法は既にインビボ研究で検証されており、図Aは、この特定の変異細胞株のRTPCR分析により、エキソンスキップによる治療の有無にかかわらず概念実証を実証した。
図Bのウェスタンブロットは、機能性ジストロフィンタンパク質が処理細胞で発現していることを示している。この治療法の効率を生体内モデルと比較すると、細胞分化技術の信頼性をサポートし、変異特異的遺伝子治療の試験に使用をサポートします。臨床研究の前に、動物および細胞モデルの能力に応じて、神経筋疾患に対する公式の治療支援の有効性をテストする必要があります。
動物モデルの開発は、今日では容易であるが、その各特定の突然変異のための実現可能な選択肢ではない。真皮線維芽細胞に由来するIPS細胞を介した筋芽細胞の生成は代替手段ですが、時間のかかる技術です。したがって、この手順は、線維芽細胞を筋芽細胞に直接変換することを可能にするIPS生成に代わる単純な方法である。
これは、筋肉生検のより侵襲的な適用を避けることによってヒト細胞モデルへのアクセスを容易にする結論として、線維芽細胞の筋芽細胞へのこの直接変換は、特定の文脈において神経筋障害の治療をテストするための強力なツールである。
