纯化的DEC-205定向抗体与全长蛋白的化学偶联，用于在体外和体内靶向小鼠树突状细胞

该方案的所有实验条件都经过仔细优化，可用于促进DEC-205抗体与OVA抗原的成功和有效的化学偶联。该技术的主要优点是它允许灵活选择蛋白质抗原和抗体，并且不依赖于这些组分的遗传融合。我们还使用该协议来生成丙型肝炎病毒蛋白的偶联物和用于体内DC靶向的抗DEC-205。

这对于抗肿瘤疫苗接种方法同样有价值。为了开始抗DEC-205生产，将一毫升体积的1至500万个解冻的冷冻保存的NLDC 145细胞重悬于9毫升37摄氏度的ISF-1培养基中，并补充1%青霉素和链霉素，并将细胞接种到25平方厘米的细胞培养瓶中，在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24至48小时。当细胞达到70%汇合度时，将整个细胞悬浮液转移到15毫升的锥形管中并通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于12毫升新鲜完整的37度ISF-1培养基中，并将细胞重新接种在75平方厘米的烧瓶中。培养48至72小时后，将70%汇合培养物分成两个新的75平方厘米烧瓶，并在每个烧瓶中加入6毫升新鲜完整的ISF-1培养基。当培养物达到70%汇合度时，使用10毫升移液管用细胞悬浮液冲洗细胞培养瓶底部和培养表面，以收集所有细胞并将每个膨胀的NLDC 145细胞悬浮液的10毫升转移到单独的PETG辊瓶中。

然后将140毫升完整的ISF-1培养基加入每个辊瓶培养物中，并以37摄氏度，5%二氧化碳和每分钟25轮的速度培养辊瓶，持续三天。对于来自NLDC 145上清液的抗体纯化，将硅管的末端放入充满上清液的烧杯中，并允许800毫升上清液滴通过蛋白质G琼脂糖柱。对于洗脱，将100微升1.5摩尔Tris-HCL加入20个1.5毫升管中，并从色谱柱上取下橡胶塞。

将一毫升0.1摩尔甘氨酸转移到柱的上腔室，并将含有淋洗液的抗体收集到制备的1.5毫升管之一中，并为每个管重复。当收集完所有抗体并汇集含抗体洗脱物后，用适当的透析管闭合20厘米长透析管的底部，并小心地将抗体洗脱液入管中。用第二个夹子关闭透析管的顶部，并将透析管的上夹固定在浮动支架上。

将磁性搅拌棒加入PBS烧杯中，然后将烧杯放在磁力搅拌器上。在四摄氏度下透析过夜后，打开一个夹具，将整个透析液装入分子量截止为10千达尔顿的离心浓缩器，然后在693倍G和4摄氏度下离心浓缩器30分钟。在离心结束时，将10毫升PBS加载离心浓缩器进行第二次离心，直到获得最终的1至1.5毫升体积的抗体溶液。

要将OVA与抗DEC-205抗体偶联，将200微升PBS加入补充500微克OVA蛋白，240微升新鲜制备的TCEP-HCL溶液和560微升无菌超纯水中至1.5毫升管中，在室温下孵育1.5小时。同时，将2.5毫克抗DEC-205在900微升PBS和100微升新鲜制备的磺胺-SMCC中加入第二个1.5毫升管中，在37摄氏度下以每分钟550转的速度在加热块中孵育30分钟。在孵育结束时，将脱盐柱与松开的盖子和扭曲的底部放入单独的15毫升锥形管中，并离心柱以除去液体。

离心后，将色谱柱置于新管中，取下盖子，并将抗体磺基-SMCC和OVA TCEP-HCL溶液缓慢上样到每个溶液一个色谱柱的紧凑树脂床的中心。离心后，丢弃色谱柱，并立即用温和移液混合抗体和OVA溶液。将抗 DEC-205/OVA 溶液加载到离心蛋白质浓缩器中，并在浓缩器中加入 PBS 至 15 毫升体积。

在2， 000倍G和室温下离心浓缩器五分钟，并在浓缩器中加入额外的10毫升PBS。在相同的离心机条件下离心浓度至少八分钟后，从上腔室轻轻收集浓缩样品。为了通过蛋白质印迹分析验证偶联的成功，将蛋白质标准品上每个样品的等分试样上样上样到SDS凝胶上，并根据标准SDS-PAGE分析方案运行凝胶。

凝胶印迹后，根据标准方案用辣根过氧化物酶偶联抗体染色膜，以检测抗DEC-205或OVA。然后可以分析膜中每个样品中相应蛋白质的存在。为了验证ELISA偶联的成功，在每孔中涂覆100微升抗OVA抗体的适当96孔ELISA板，并以1至2的比例和封闭缓冲液连续稀释抗DEC-205 / OVA，以获得从每毫升6微克到每毫升93.8纳克的稀释液。

将每个稀释液中的100微升加入抗体包被板的适当孔中，在室温下孵育一小时。在孵育结束时，向板中加入100微升针对抗DEC-205 / OVA偶联物的辣根过氧化物酶偶联抗体，在室温下孵育一小时，然后向每个孔中加入50微升辣根过氧化物酶底物，以便通过分光光度法分析颜色反应。平行蛋白质印迹分析可用于检测共轭OVA和共轭抗DEC-205。

OVA染色将允许检测过量的游离OVA（如果存在），并且抗DEC-205染色通过增加裸抗DEC-205和偶联物之间的分子量来验证偶联的成功。ELISA还可用于评估偶联的成功，检测信号与分析的蛋白质量之间存在正相关，表明抗DEC-205 / OVA偶联剂的成功生成。流式细胞术和免疫荧光分析清楚地表明，抗 DEC-205 核心可有效结合骨髓来源的 CD11c 阳性细胞。

与单独接种OVA和佐剂相比，抗 DEC-205/OVA 联合佐剂接种疫苗可诱导小鼠受试者 OVA 特异性 IgG 滴度增加。此外，抗 DEC-205/OVA 可有效诱导超特异性 CD4 和 CD8 阳性 T 细胞反应，抗 DEC-205/OVA 诱导的 CD8 阳性 T 细胞反应显著超过单独 OVA 诱导的反应。为了使OVA抗原成功与抗DEC-205抗体偶联，重要的是要按照证明制备材料并在一致的条件下执行偶联步骤。

在抗原和抗体成功偶联后，许多后续方法是可能的，包括结合分析和在体内诱导病原体或肿瘤相关免疫。