活联甘蔗，用于亲和色谱树脂的快速发展 - 抗体捕获作为案例研究

单克隆抗体主导着生物制药市场，通常通过蛋白质 A 色谱法进行纯化。根据树脂是生产过程中影响抗体治疗价格的主要成本驱动因素。在这里，我们描述了一种新的亲和力配体基于荧光蛋白，被读取为HIV中和抗体2F5的线性表位载体。

一般来说，我们的方法允许快速生成亲和力色谱树脂，可用于捕获单克隆抗体。我们通过从粗植物提取物中捕获抗体2F5来证明这一能力。我们优化了捕获条件和溶液缓冲液，以提高动态结合能力和树脂可再使用性。

我们的树脂通常比蛋白质 A 条件宽松，并且有可能降低单克隆抗体的纯化成本。此外，树脂可以很容易地适应其他抗体，结合线性表位。要开始此过程，请调整已准备的亲和力配体溶液的浓度，以便根据实验设计定义，浓度在每升 5 到 15 克的范围内。

将溶液存放在冰上，直到耦合反应就绪。接下来，用 DFE 溶液填充一个两毫升注射器。并准备一个适配器，将注射器安装在NHS激活的交叉链接的阿加罗斯柱上，床容为1毫升。

对于用于耦合的每 10 列，准备 30 毫升的停用溶液、30 毫升的低 pH 溶液和 1 毫升的存储溶液。然后在管子中准备20毫升一毫升盐酸。并在冰上孵育至少20分钟。

准备精密刻度，以监控耦合反应期间所有步骤的流经分数。在此之后，打开一个密封的 NHS 激活的交联阿加罗斯柱。将一滴缓冲液涂抹到适配器入口上，以防止空气进入柱。

将注射器适配器安装在柱入口。用六毫升冰冷一毫升盐酸清洗柱子，流量小于每分钟一毫升。使用两毫升注射器，立即以低于每分钟 1 毫升的流量注射 1.5 毫升的 DFE 溶液。

并收集通过分数的精度尺度，以便进行后续分析。在22摄氏度下密封柱子，孵育15至45分钟。接下来注射六毫升的活化溶液，然后注射六毫升的低pH溶液，以低于每分钟一毫升的流速，从树脂中去除非共价结合配体。

注射6毫升的激活溶液，并孵育该柱15分钟。在此之后，将六毫升的低pH溶液注入柱中。然后是六毫升的激活解决方案。

然后再将六毫升的低pH溶液注入柱中。将两毫升的存储溶液注入柱中，并将其储存在四摄氏度。首先准备100毫升的澄清植物提取物包含2F5，或上清液为首选基于细胞的表达系统，其中也包含2F5。

接下来准备平衡缓冲器，以及文本协议中概述的高铁 X 强度错觉缓冲器。用缓冲器冲洗色谱系统。在色谱系统上安装 DFE 亲和力柱。

与五 CV 的平衡缓冲液进行平衡，流量为每分钟一毫升。以 280 纳米监控紫外线吸收度。然后以每分钟 5 毫升的流速将 80 毫升的澄清植物提取物或上清液加载到柱上。

保证接触时间为两分钟。以两毫升分数收集通过样品的流量或突破性曲线重建。如果无法立即进行样品分析，则将流经样品的流量储存在四摄氏度。

在此之后，用 6CV 的平衡缓冲液清洗柱。在洗涤的开始、中间和结束收集样品。使用五卷高离子强度幻象缓冲液稀释 MAB2F5。

当 280 纳米的 UV 信号增加到基线以上的 5 毫吸收度单位时，收集 DFE 分数。优化每个表位抗体对的幻象缓冲液，如文本协议中所述。融合蛋白DFE在生长在温室的转基因烟草植物中表达。

DFE的整体回收量为每公斤23.5毫克。纯度超过 90% 时，树脂上固定的 DFE 绝对量随 DFE 质量注入柱中而增加，并且以每升 15 克左右的速度稳定，而耦合产量随着注入更多 DFE 而持续下降。即使在耦合后，DFE分子也被认为可以保留其红色荧光。

颜色强度对应于固定 DFE 的总量。因此，列颜色可以用作简单的质量控制参数，以估计耦合效率和列质量。重组2F5抗体在生长于植物龙的尼科蒂亚娜本thamiana植物中暂时产生。

从粗植物提取物中捕获 2F5，使用亲和力柱进行测试，并结合约 7 毫克纯化 DFE 进行测试。氯化镁浓度为1.25摩尔，足以从DFE亲和树脂中吸收2F5，回收率接近100%，纯度约为97%，可与蛋白质 A 树脂相媲美。DFE 亲和树脂的 DBC 突破 10%2F5，在 25 个周期中呈线性下降，约为初始值的 15%。

我们使用实验方法的设计来优化我们的亲和力配体耦合能力。这些条件可以针对将来的其他配体进行微调。我们的方法使用荧光蛋白为产品特异性配体线程亚载体蛋白。

同时，只需添加功能作为动员程序的视觉质量指标，立即向操作员提供直观的反馈。