在这里，我们演示了上格拉夫方法，世界上最广泛使用的方法，用于估计结晶纤维素含量。纤维素基本上由葡萄糖单体组成，由β-1，4糖体键连接。我们把这个协议分为五个阶段。
在第一阶段，我们准备植物生物质材料。在第二阶段，我们提取粗糙的细胞壁。在第三阶段，我们使用上格拉夫治疗，其中上皮草是由醋酸和硝酸，帮助从我们的样品去除血糖素和木质素。
在第四阶段，我们通过硫酸使其进行酸水解，硫酸产生葡萄糖单体。最后，在第五阶段，我们使用炭铁检测来估计结晶纤维素含量。从温室收集植物材料，用水彻底清洗，空气干燥两天，分离组织，将组织转移到单独标记的容器中，在49摄氏度的孵化器中孵化10天。
最后，用剪刀或刀片切成碎片。冻结组织，加载到砂浆和虫子细磨成均匀的粉末或替代使用冷冻机/磨坊。在这里，我们演示使用冷冻机/磨坊，所以我们加载我们的组织样品到这些研磨瓶，并把它们放在冷冻机/磨坊，并运行三个周期的10 CP速度。
组织粉末收集在猎鹰管，如图所示。称20毫克的组织粉末，并转移到预称的两个mL管。添加一毫升蛋白质溶解缓冲器以去除蛋白质。旋涡。
离心机在 15，000 RPM 下五分钟。丢弃超自然人。再重复此步骤两次。
在保留的颗粒中加入一毫升无菌水。旋涡。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。再重复此步骤两次。
在保留的颗粒中加入一个 70% 乙醇的 ML。旋涡。转移到预热的70摄氏度区块，同时摇晃一小时。经过一个小时的孵化，离心机在15，000 RPM下5分钟。
再重复一次此步骤。在保存的颗粒中，添加100%甲基酮的一毫升。旋涡。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。
加入一毫升氯仿甲醇。旋涡。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。丢弃超自然，并添加一毫升的色酮。旋涡。
在室温下孵化五分钟。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。在 37 摄氏度的气温下重新丢弃超自然和空气干燥它们过夜或继续真空干燥。
将样品放入真空干燥机，干燥两到三个小时，或直到颗粒完全干燥。重五毫克的细胞壁提取物从上一步获得。转移到一个两个mL螺丝帽管。
在这一点上还包括积极的控制。为此目的使用两毫克的什么人滤纸。转移到两个mL螺丝帽管。
在每个称重细胞壁提取物中加入 1.5 mL 的 Updegraff 试剂。在预热区块中以 100 摄氏度的漩涡和孵育 30 分钟。30分钟后孵化，转移到机架上。
让它在长凳上冷却10分钟。离心机在 15，000 RPM 10 分钟。丢弃超自然，而不会干扰颗粒。
加入一毫升无菌水。旋涡。离心机在 15，000 RPM 10 分钟。丢弃500微升的超自然人。
添加一毫升的音调。旋涡。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。丢弃超自然人的一毫升。
添加一毫升的音调。旋涡。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。完全丢弃超自然。
添加一毫升的音调。旋涡。离心机在 15，000 RPM 下五分钟。丢弃超自然人。
在37摄氏度下干燥过夜。经过一夜的孵化，转移到机架上。加入一升67%硫酸。旋涡。
在25摄氏度下孵化一小时，同时摇晃。经过一个小时的孵化，确保颗粒完全溶解。转移到机架上。
这是纤维素提取的最后一步。现在样品已准备好稀释样品。对于样品稀释，使用上一步每个样品的 10 微升，并添加 490 微升无菌水。
对于所有实验样本重复此步骤。对于葡萄糖标准曲线准备，准备每毫升葡萄糖1毫克的新鲜库存，并准备零微克至200微克浓度，每毫升葡萄糖增加1毫克，并用无菌水将最终体积加到1毫克。在螺丝盖管中取下每个预制标准的 500 微升，并添加 1 mL 0.2% anthrone。
现在样品已经准备好进行炭铁检测了。添加一毫升新准备的炭毒。立即通过漩涡混合并转移到冰上。
以同样的方式重复所有标准和样品。然后转移到预热的100摄氏度区块10分钟。孵化10分钟后，转移到冰上，在冰上孵化5分钟。
孵化后，在三个复制品中取取每个样本的 200 微升。以同样的方式重复标准和样品。一个装有96井的板子被装进了多模探测器。
使用智能 Max Pro 程序，我们将滤镜设置设置设置为 620 纳米。板型到 96 井型。选择所有阅读区域。
单击"确定"。读。阅读板。您将获得标准和样品的吸收读数，这些读数将收集在 Excel 表中，以便进一步分析和估计纤维素含量。
葡萄糖标准曲线是利用 x 轴上每 mL 微克的葡萄糖浓度和 y 轴上 620 纳米的相应浓度的标准化吸收值来编制的。我们得到的回归线与m和c值在绘图散射图中，我们用来估计样品晶体纤维素含量。在第一步中，我们平均OD值为620纳米。
然后，我们通过减去空白值使数据正常化。我们使用公式 x 计算葡萄糖浓度等于 OD 减去 c/m，其中我们从标准曲线中回归线的前一步插入 c 和 m 值。由于用于炭细检测的总体积为 500 微升，因此我们将其除以稀释因子 2。
由于使用的样品体积只有10微升，我们将进一步除以10，以获得微克每微升葡萄糖浓度，这相当于毫克每毫升浓度。然后我们使用水分因子1.11，这是在这个过程中的水分增益。最后，我们通过将其与细胞壁重量（接近 5 毫克）除以并乘以 100 以获得百分比来计算晶体纤维素含量的百分比。
然后，我们平均三个生物复制品的晶体纤维素含量，以获得单个样本的价值，这将与另一个实验线平均三个生物复制品进行比较。t 测试可用于测试其重要性。在表 A 中，我们显示浓度的表值和相应的 OD 值为 620 纳米，进一步用于绘制散射图和回归线，其中使用 C 中使用的 m 和 c 值来获取两个实验线之间的纤维素含量差异。
最后，两个样本都显示出纤维素的差异。谢谢你的收看。
