优化了炔基脂肪酸类似物的掺入，用于使用点击化学检测脂肪酰化蛋白

这种方法改善了脂肪酸向细胞的递送，并保护它们免受游离脂肪酸递送的毒性作用，从而确保更一致的标记。点击化学检测的灵敏度和效率取决于脂肪酸标记的有效摄取。我们已经证明，这可以大大改善。

该协议的几个步骤非常具体，需要密切关注。例如，视觉演示可以澄清和展示如何避免在标签混合物中形成固体。为了制备标记介质，用5%葡聚糖/木炭包被的FBS，1X青霉素链霉素，2毫摩尔L-谷氨酰胺和100毫摩尔丙酮酸钠补充DMEM，然后在使用前将其预热至37摄氏度。

在一天前在具有PBS的六孔组织培养皿中轻轻洗涤HEK-293 T细胞，然后用标记培养基代替PBS。用5%二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞约45分钟，然后用脂肪酸进行代谢标记。为了皂化脂肪酸类似物，将至少两微升的炔基脂肪酸类似物直接移液到三毫升锥形反应小瓶的底部。

在靠近反应瓶底部的玻璃边缘移取等量的稀释氢氧化钾，使得分配的氢氧化钾体积与脂肪酸混合。合上小瓶盖，轻轻敲击以混合溶液。将反应瓶在65摄氏度下加热约五分钟或直到溶液变得清晰，表明脂肪酸已被掺入。

但是，请注意液体不会蒸发太多。接下来，移液器预热20%无脂肪酸BSA，使得脂肪酸与氢氧化钾与无脂肪酸BSA的体积比为1-1-50，达到20X BSA结合的炔基脂肪酸的最终浓度。通过上下移液来混合溶液，然后在37摄氏度下孵育15分钟。

通过将20X脂肪酸BSA偶联物直接加入饥饿培养基中来标记HEK-293 T细胞，以在25微摩尔炔基肉豆蔻酸酯或100微摩尔炔基棕榈酸酯和硬脂酸炔基中达到1%BSA的最终浓度。为了进行比较，通过将两微升未标记的脂肪酸直接移入饥饿培养基中来添加非皂化液体，然后将细胞放回培养箱中三到六个小时。孵育完成后，在室温下用PBS轻轻洗涤细胞，然后通过加入500微升不含EDTA的改性RIPA缓冲液并在4摄氏度下旋转裂解物15分钟来收获和裂解细胞。

将裂解物以16， 000 g在4摄氏度下离心10分钟，然后将上清液收集在1.7毫升微量离心管中并将其储存在零下20摄氏度。使用不含EDTA的改性RIPA缓冲液，将1.7毫升微量离心管中的50至100微克蛋白质裂解物取至等体积。保持反应量尽可能小。

向每个样品中加入STS以达到1%的最终浓度 制备点击试剂的预混液，并将适当体积添加到裂解液中，然后通过上下移液进行混合。将裂解物在37摄氏度的水浴中在黑暗中孵育30分钟，偶尔混合。对于免疫沉淀，将裂解物与兔抗GFP混合，并在4摄氏度下旋转孵育过夜。

向每个管中加入15至20微升预先平衡的0.1%SDS RIPA磁珠，并使其在4摄氏度下末端反应三小时。用裂解缓冲液洗涤珠子，并重悬于含有1%SDS的45微升50毫摩尔HEPES缓冲液中。将珠子在80摄氏度下加热15分钟。

在孵育期间，大约每五分钟倒置或搅拌一次管子，然后短暂旋转所有管子。当样品仍然温热时，收集含有蛋白质的上清液。将43微升上清液与7微升的点击试剂预混液混合，并让它们在37摄氏度下在黑暗中反应30分钟。

在西方图中，随着酰链长度的增加，在皂化和非皂化炔基脂肪酸之间的点击化学检测的标记效率中观察到显着的影响。在用硬脂酸炔基标记的细胞中，脂肪酸的皂化和用于代谢标记的BSA递送通过点击化学和荧光氮杂探针检测大大增加了S-酰化蛋白信号的检测，表明炔基脂肪酸标记的细胞掺入总体上增加。相反，在用最短和最易溶性脂肪酸烷炔基肉豆蔻酸酯处理的细胞中未观察到显着差异。

与肉豆蔻酸炔基酯相比，用棕榈酸炔基标记的细胞显示出标记的中间增加，但小于硬脂酸炔基。重要的是，用0.1摩尔氢氧化钾处理PVDF膜在很大程度上从用棕榈酸炔酯和硬脂酸炔酯孵育的细胞中去除了脂肪酸标记，证实大部分信号是通过酯或硫酯键。正如预期的那样，由于肉豆蔻酸酯通过酰胺键附着在蛋白质上，因此炔基肉豆蔻酸酯的掺入主要是耐碱的。

点击化学后，在免疫沉淀物和裂解物中检测到野生型肉豆蔻酰化C端亨廷顿GFP的肉豆蔻酰化，而G2A突变完全阻断了C端亨廷顿GFP的肉豆蔻酰化。点击化学后，我们可以对脂肪酰化蛋白进行亲和纯化以进行质谱分析。这可能通过保护细胞免受毒性而产生脂肪酰化蛋白的不同谱。