使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选

该协议为筛选核酸酶活性作为疾病的生物标志物提供了一种强有力的替代方案，即使对于不太专门研究核酸探针的研究人员，也提供了易于实施的方法。该技术的主要优点是能够选择核酸探针，可以识别已知和未知的核酸酶活动，利用探针-核酸酶动态相互作用。这种方法的其他优点是灵活性、高可重复性和易用性。

示范将由硕士生卡迪娅和来自我们实验室的博士后巴里斯进行。在设计寡核苷酸库时，至少包括一个DNA和一个RNA随机序列，其中包含腺氨酸、瓜氨酸、细胞氨酸和硫胺或乌拉西尔的组合。为了准备寡核苷酸探针，旋转低干寡核苷酸探针，以每微升浓度500皮摩尔稀释Tris-EDTA缓冲液中的每个探针，以防止核酸酶降解。

对于固体介质上的细菌培养，将单个多孔玻璃珠从低温储存直接卷到含有 TSA 的培养皿上，并辅以除颤羊血，以划掉单个细菌菌落。然后将板在37摄氏度下放置24小时。对于液体介质中的细菌培养，将单个菌落从固体培养体转移到 50 毫升 TSB，在 37 摄氏度下孵育，每分钟 200 次旋转 24 小时。

第二天，在新鲜的TSB中，以1比500的比例稀释培养物，并在37摄氏度下再孵育细菌24小时，并在摇动的培养箱中每分钟旋转200次。要建立核酸酶活性测定，首先将荧光计预热至37摄氏度，并小心地将96微升无菌TSB或上清液从沙门氏菌或大肠杆菌液体培养物添加到每个探针1个1.5毫升无核酸酶微离心管中。在每个管中加入四个微升探针工作溶液，并使用移液器彻底混合每个管内，直到实现均匀溶液，注意避免气泡。

接下来，小心地将95微升的每个溶液装到靠近黑底壁的个别井壁上，不经过处理的96孔板，注意避免气泡。添加所有溶液后，盖住板并目视检查盖子上是否带有笔标记或灰尘，这些标记或灰尘可能会引入测量伪影。要设置核酸酶活性测量软件，请打开合适的采集软件程序。

从"任务管理器"窗口中选择"现在阅读"，然后选择"新"以创建动力学测量协议。单击"设置温度"以选择 37 摄氏度，然后单击"确定"确认并保存设置。单击"开始动力学"。在弹出窗口中，在"运行时"输入框中选择两个小时，在间隔输入框中选择两分钟，然后单击"确定"以确认和保存设置。

单击"阅读"。在弹出窗口中，选择荧光强度作为检测方法，选择端点动力学作为读取类型，选择滤波器作为光学类型。然后单击"确定"。在弹出窗口中，从"筛选集"中选择"绿色"，然后单击"确定"。在"过程"窗口中，选择"使用盖子"并单击"验证"。

将出现一个弹出窗口，确认创建的协议有效。在"协议"菜单下，选择"过程"。在"过程"窗口中，定义要测量的井，并在"文件名称输入"框中输入实验的名称。

然后将板加载到板读卡器中，注意板位于右方向，然后单击"读取新"按钮开始采集。对于数据分析，请在相应的分析软件中打开数据，并在一个窗口的板中选择一个测量孔。单击"选择井"并在"井选择对话框"窗口中包括所有测量的孔，然后单击"确定"。然后选择板一窗口中的数据以可视化制表结果，然后单击"快速导出"将数据导出到电子表格。

在电子表格中，将数据列标记为适合每个样本和探头，并绘制相对荧光单位与数据生成动能图的时间。在这个具有代表性的实验中，在第一轮筛查之后，沙门氏菌培养超先剂报告了RNA探针比DNA探针的明显偏好。基于对RNA作为沙门氏菌核酸酶首选核酸类型的鉴定，设计了一个新的RNA库，用于第二轮筛选。

相比之下，培养基对控中的E.Coli表明，降低RNA探针的能力非常有限。在使用化学修饰核苷酸进行第二轮筛选，旨在提高RNA探针的特异性后，可根据其化学修饰确定RNA苯丙胺2'O-甲基和RNA紫菜2'O-甲基分别表现出最佳的动力学行为，与RNA pyrimidine 2'氟和RNA紫福二氟相比，表现出最佳的动力学行为。这些结果表明，沙门氏菌具有重要的RNAse活性，具有差分基质化学偏好，可用于选择能够专门识别这种细菌的探针。

此过程能够选择能够识别与疾病条件（如癌症或细菌感染）相关的核酸酶活动的探针，从而开发新的临床诊断工具。