肿瘤移植用于评估小鼠肿瘤浸润CD8 ⁺ T细胞的动力学

该方法可以帮助回答肿瘤免疫学中的关键问题，包括外周组织中是否存在肿瘤特异性免疫细胞的补充，肿瘤微环境中新浸润的免疫细胞与已经存在的免疫细胞之间的过渡，以及它们对免疫治疗的反应。这是一种方便且易于遵循的技术，用于区分外围来源的细胞和肿瘤浸润的免疫细胞，并在纵向测定中跟踪这些细胞的动态，表型和功能变化。首先将100微升制备的B16F10-OVA细胞悬浮液取出到1mL结核菌素注射器中。

点击枪管将所有气泡移动到顶部，然后轻轻推动柱塞以去除气泡。限制鼠标露出腹部。用小指按压左后腿，收紧左腹股沟区域的皮肤。

用电动剃须刀从左下腹部除去老鼠的头发。使用浸泡在75%乙醇中的棉花清洁左腹部的后象限。以0至15度之间的浅角度握住注射器，针头的斜面朝上，将其插入左大腿上部的一侧。

将针头推进0.5至1厘米，穿过皮下组织进入腹股沟区域。注射前拉回柱塞。如果存在负压，请完全按下柱塞，观察皮下腔内小液体袋或推注物的形成。

注射后取出针头。松开鼠标并将其放回笼子中。在B16F10-OVA植入后的第六天至第八天，用游标尺测量肿瘤大小。

选择直径约为三毫米的小鼠或绿豆大小的肿瘤，并将它们平均随机分成两组。将200微升OT-1细胞悬浮液取出到100单位29号胰岛素注射器中并去除气泡。将小鼠单独放在笼子中，用红外灯在笼子上放置5至10分钟以扩张尾静脉。

用适当大小的抑制装置固定鼠标。握住尾巴将其拉直，喷洒75%乙醇以使静脉可见。将注射器与静脉平行，并以0至15度的角度将其插入静脉。

稍微拉回柱塞，如果血液进入桶，则以不超过每分钟一毫升的速度缓慢而稳定地注入悬浮液。注射完成后，取出注射器，轻轻按压注射区域三到五秒钟以止血。将小鼠放回笼子，仔细观察几分钟，以发现不良反应。

如果它具有正常的活动性和鼻腔分泌物，请将其放回其他小鼠的陪伴下。过继转移后8〜10天，选择携带直径约5毫米的类似肿瘤质量的供体小鼠进行移植手术。将100毫米×20毫升的培养皿放入生物安全柜中，并加入10毫升无菌的冰冷PBS。

对小鼠实施安乐死后，将其浸入75%乙醇中三至五分钟。将小鼠置于生物安全柜中覆盖有干净吸收纸的解剖板上的仰卧位置。用解剖针限制小鼠四肢。

用剪刀沿着中线从尿道孔口上方切开皮肤到剑鞘。用镊子将皮肤向小鼠身体的左侧伸展，并用解剖针约束皮肤。切除肿瘤，保持其胶囊尽可能完整。

用手术剪刀小心轻轻地去除肿瘤附近的结缔组织，然后将肿瘤组织放入含有无菌，冰冷PBS的培养皿中，以便随后移植。在眼睛上使用兽药软膏，以防止眼睛干燥。用电动剃须刀剃除小鼠的左侧，然后涂抹脱毛膏以去除剩余的毛发。

将小鼠置于生物安全柜内的俯卧位置，该解剖板上覆盖着干净的吸水纸，小鼠的垂直轴平行于实验者的头部。用浸泡在聚维酮碘中的棉花擦拭剃须区域的皮肤。用手术镊子抬起小鼠髋关节之间的中点皮肤。

使用剪刀进行五毫米长的垂直切除，并将切口沿背中线向臀部延伸至约10至15毫米。通过将剪刀的闭合尖端插入切口，然后打开以将左侧腹膜与皮肤和软组织分开来进行尖锐的解剖。进行多次尖锐的解剖，以在左侧形成一个皮肤口袋。

将封装的，完整的，供体来源的肿瘤肿块放入口袋中。用中断的缝合线关闭切口，每个切口使用两针或三针。用浸泡在聚维酮碘中的棉花对切口周围的皮肤进行消毒。

将鼠标放在干净温暖的笼子中的横向位置。持续监测，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。以每8小时每公斤体重0.1毫克的剂量皮下注射丁丙诺啡，共三剂。

只有在移植受者完全康复后，才将其送回其他动物的陪伴下。使用流式细胞术，在肿瘤微环境中很容易鉴定出CD44阴性和CD8阳性肿瘤抗原特异性T细胞群，包括CD45.1阳性供体来源和CD45.1阴性和CD45.2阳性受体来源的肿瘤浸润CD8阳性T细胞。在移植后的第二天，移植肿瘤内约有83%的供体源性抗原特异性CD8阳性T细胞，比受者来源的对应物更占主导地位。

受者来源的OT-1细胞的比例在肿瘤发生晚期升高，超过了来自供体的肿瘤固有的OT-1细胞。最重要的是要记住，在皮下肿瘤移植期间进行轻柔的清扫，以避免周围组织受伤，特别是在颗粒状淋巴结中。