我们提出了一种利用OP9-Delta-1共培养系统产生人类诱导多能干细胞衍生肿瘤抗原特异性CD8αβ单阳性T细胞的方法。这种方法是体外T细胞生成的有力工具，将促进体外衍生T细胞的发展，用于再生医学和基于细胞的疗法。它也可以适应其他淋巴细胞的产生，如NK细胞。
执行此技术时，当细胞对细胞细胞质接触开始防止细胞分化和衰老时，必须一致地预先评估 FBS 和通过 OP9-Delta-1 细胞的很多。演示手术将是梅甘古德博士，一个外科肿瘤学研究员从我的团队。首先在立体显微镜中检查人类 iPSC 菌落，并消除与 200 微升移液器尖端的塑料边缘从培养中区分的任何区域。
当菌落达到0.8至1.2毫米的直径，通过人类的psCs。吸气的已花介质，并添加10毫升的人类 iPSC 介质辅以 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。将一次性细胞传通工具在一个方向上滚动整个培养皿，确保保持均匀的压力，并且整个滚轮刀片接触培养皿。
旋转培养皿 90 度，并重复滚动。用显微镜直观地确认菌落的正确切割。它们应显示为选中。
然后，用200微升移液器轻轻的机械冲洗来分离切口菌落。目测地估计成分之块的数量，将350到600团转移到新的10厘米的小鼠胚胎成纤维细胞中，配以10毫升新鲜人类iPSC介质，并辅以 ROCK抑制剂。在37摄氏度下孵育一夜。
第二天，吸进已花的介质，并添加10毫升的新鲜人类 iPSC 介质。根据细胞生长速率，每一两天更换一次介质。在37摄氏度的OP9介质中培养OP9-Delta-1细胞。
当它们达到汇合时，吸气介质，用5毫升1倍镁、钙和苯酚无红色PBS清洗细胞一次。吸气PBS，加入两毫升05%的三辛-EDTA，并在37摄氏度下孵育细胞5分钟。然后，添加四毫升的OP9介质，通过移液机械分离细胞层。
通过100微米细胞过滤器将悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在4摄氏度下以300倍g离心5分钟。吸升液，并在OP9介质的12毫升中重新暂停细胞。在每个六个新的细胞培养皿中加入八毫升的OP9培养剂，并将OP9-delta-1细胞悬浮液的两毫升盘盘添加到每个培养皿上。
将菜侧对边、从前摇到后面，确保细胞的均匀分布。在37摄氏度下孵育细胞，当细胞达到汇合时重复通过。在与人类 iPSCs 共同培养前一周准备明胶化 OP9-Delta-1 菜肴。
在三个新的细胞培养皿中加入四毫升0.1%明胶，并在37摄氏度下孵育30分钟。孵育后，吸明胶，并在每道菜中加入8毫升OP9介质。将 OP9-Delta-1 细胞的一个汇合盘传递到三个明胶涂层的盘。
四天后，在每盘细胞中加入10毫升OP9培养剂，每盘共20毫升的介质。在细胞经过7至8天后，开始人类在OP9-Delta-1汇合盘上共同培养。从人类 iPSC 的汇合盘中吸出介质，并添加 10 毫升 OP9 介质。
使用一次性细胞传传工具切割和分离细胞菌落，将 350 至 600 团切菌落转移到含有 10 毫升新鲜 OP9 培养基的预凝胶化 OP9-Delta-1 培养皿上。将文化菜并排和正面到背面摇动，以确保殖民地的均匀分布。第二天，吸进已花的介质，代之以20毫升的新鲜OP9介质。
在OP9-Delta-1上共同培养的人类 iPSC 团块应显示为小、圆形、单层菌落。第五天，吸气10毫升的已花介质，并添加10毫升的新鲜OP9介质。殖民地将开始分化成原始的中皮，其特点是多层黑暗中心。
在第九天重复此过程，此时多层中心结构将演变为圆顶形状。在第13天收获造血前细胞，此时这些结构由一个黑暗的中央器官组成，周围环绕着一个圆顶状区域网络。吸气介质，用5毫升1x苯酚无红汉克斯的平衡盐溶液与钙和镁或HBSS洗涤细胞一次。
洗涤后，加入250微升，每毫升5000单位胶原酶IV至10毫升HSSS。将混合物加入细胞中，在37摄氏度下孵育45分钟。吸气HSS-胶原酶混合物，用五毫升PBS洗涤细胞一次。
用PBS洗涤后，加入5毫升0.25%的三辛-EDTA，并在37摄氏度下孵育细胞20分钟。然后，添加四毫升的OP9介质，通过移液分离细胞层，使单细胞悬浮。通过100微米过滤器将悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在300倍g和4摄氏度下将管离心5分钟。
吸上一道，并在OP9介质的10毫升中重新暂停细胞。将细胞悬浮液板在一个新的明胶化10厘米细胞培养盘上，并在37摄氏度下孵育45分钟。然后，通过温和移液收集任何非粘附细胞。
将电池悬浮液通过过滤器转移到 50 毫升锥形管中，然后像前面所述的离心机。然后，吸升液，并在10毫升的分化介质中重新暂停细胞。将细胞悬浮板到新的OP9-Delta-1汇合盘上。
根据第16天根据手稿指示通过细胞，并在之后每5至7天继续通过非粘附细胞。经过35天的分化，根据制造商的协议，通过CD4磁珠分离来丰富CD4阳性细胞群体。然后，在OP9培养中重新悬浮细胞，将一毫升细胞悬浮液板入组织培养、平底、24井的汇合OP9-Delta-1的每个井中。
通过添加100个国际单位的人类IL-2、5纳米的人类IL-7、500纳米的抗人CD3抗体和2微克的抗人CD28抗体来刺激细胞。四到七天后，可以收集细胞作进一步分析。在人类干细胞因子、人类FLT3配体和人类白细胞-7存在的情况下培养非凝胶化OP9-Delta-1后，造血干细胞分化成CD3、CD7、CD4和CD8双阳性T系细胞，其中大多数表示M细胞受体特异性MART1表皮。
当CD4、CD8双阳性T细胞在人际白细胞-7和2存在的情况下用抗人CD3和CD28抗体刺激时，CD3阳性CD8αβ单阳性细胞的数量增加，并且仍然特定于MART1表位，确认其遗传抗原特异性的保存。ELISpot测定显示，当在MART1肽存在的情况下培养时，与散装细胞和CD8α阿尔法单阳性T细胞相比，人类ipSC衍生的CD8β单阳性T细胞分泌更多的干扰素伽马。未检测到T细胞和抗原呈现细胞的干扰素伽马表达，表明人类T-iPSC衍生T细胞具有抗原特异性和功能。
这种方法的一个重要步骤是CD4磁珠富集，以消除CD4阴性，CD8阴性双阴性细胞，这可能会导致刺激时直接杀死双阳性细胞。该技术适用于多种人类细胞来源，包括造血干细胞和胚胎干细胞。该方法产生的 iPSC 衍生的未成熟 T 细胞可进一步改进，用于生成成熟人类肿瘤抗原特异性天真类 T 细胞，供将来治疗使用。
观看此视频后，观看者应了解如何使用 OP9-Delta-1 共培养系统生成人类 iPSC 衍生 CD8 alpha β 单阳性 T 细胞。
