一种从人类多能干细胞中生成肾类器官的简化方法

该方法可以在任何配备细胞培养实验的实验室中进行。使用这种方法，我们可以进一步了解肾脏发育和疾病通路。与其他用于产生肾脏类器官的方法相比，这是一种相对简单且便宜的方法。

该技术的最大挑战是维持高质量的人类多能干细胞培养。至关重要的是，细胞保持在小于80%的汇合度并定期分裂。刚接触人类多能干细胞培养的研究人员在进行分化之前，应熟悉干细胞系。

通过将两毫升完整的E5-ILP培养基加入六孔超低附着板的每个孔中来开始肾类器官测定。在100毫米组织培养处理的平板中培养人多能干细胞或hPSCs，直到它们达到60%汇合度。用大约8毫升DPBS洗涤hPSCs两次。

吸出DPBS，然后滴加两毫升分散酶以覆盖细胞，并在37摄氏度下孵育六分钟。用大约10毫升DPBS洗涤细胞三次。吸出DPBS，然后将板倾斜45度，并用细胞提升器将细胞刮下。

使用10毫升血清移液管用六毫升完整的E5-ILP培养基从顶部冲洗菌落。然后，垂直握住移液器，通过轻轻上下移液来分解大的菌落，注意不要接触培养板的侧面。通过将每孔一毫升加入六孔板来均匀分布菌落簇，然后将板置于37摄氏度培养箱内的轨道振荡器上。

或者，如果没有轨道振荡器，则可以静态培养细胞。在第二天，让胚体沉降在板的底部后，将板倾斜45度，然后从顶部缓慢吸出培养基，每孔留下一毫升。每孔加入两毫升制备的完整培养基，并将板放回摇摇杯中。

在第三天，如前所述吸取培养基后，使用10毫升血清学移液管从每个孔中仔细收集所有胚体，并将其转移到50毫升锥形管中。要收集任何剩余的胚体，请用一毫升低葡萄糖DMEM冲洗每个孔，并将它们添加到相同的50毫升锥形管中。在等待胚体沉降在管的底部时，向六孔板的每个孔中加入两毫升的II期培养基。

接下来，通过将200微米的细胞过滤器放在新的50毫升锥形管的顶部，并将所有胚体小心地移液到细胞过滤器上，筛选出大的胚状体。用另外五毫升DMEM冲洗细胞过滤器，以收集卡在过滤器中的任何胚状体。在后期阶段，首先使用500微米的过滤器筛出非常大的胚状体，然后将滤液通过200微米的过滤器筛出非常小的胚状体，没有小管。

通过将200微米过滤器倒置到新的50毫升管中并用DPBS洗涤过滤器，收集200至500微米之间正确尺寸的胚体。过滤后，让胚体沉降到锥形管的底部，然后吸出上清液，并用约10毫升DMEM洗涤。然后，将胚体重悬于六毫升的II期培养基中。

将胚体移回六孔超低附着板中，将它们均匀地分布在孔中。由于大多数类器官聚集在移液器的顶部，因此在末端留下约半毫升，然后轻轻地将尖端触摸到每个孔中的培养基，使类器官流入孔中。将胚体转移到带有45毫升II期培养基的125毫升旋转瓶中。

将磁力搅拌速度设置为120 rpm，并将烧瓶放入培养箱中。为了喂养胚体或肾类器官，让它们短暂地沉降到旋转瓶的底部，然后从烧瓶的一侧臂上提起盖子，并将吸气移液器放在里面，尖端接触对面的内壁。慢慢地将移液器向下倾斜，并吸出大约一半的培养基。

通过同一开口移液，用20毫升新鲜的II期培养基补充。使用长无菌镊子小心地将一个磁力搅拌棒放入具有胚体或肾类器官的六孔板的每个孔中。将板放在六轮磁力搅拌板上，并将速度设置为120 rpm。

要使磁力搅拌棒卡入到位并开始旋转，请首先将功率水平设置为100。一旦所有棒材开始旋转，将功率水平降低到25。如前所述，通过改变一半的培养基来维持肾脏类器官。

第 14 天肾类器官石蜡切片的免疫荧光显示存在肾单位节段，例如表达肝细胞核因子-1 β 和莲花四蕈洛布斯凝集素的肾小管，以及表达 V-maf 肌肉腱鞘神经纤维肉瘤同源物 B 和肾素的足细胞簇。该方案中的修饰可以支持内皮细胞的扩增，正如在培养的第26天用血小板和内皮细胞粘附分子-1染色所证实的那样。人类多能干细胞需要用Dispase处理适当的时间，然后彻底洗涤以去除所有痕迹。

如果分散酶没有被完全去除，它可能导致细胞死亡和胚胎体聚集。这种方法帮助我们研究了先天性肾脏疾病的发展，以及各种肾损伤途径和体外治疗干预的潜力。