首先，用Dulbecco的PBS或DPBS洗涤培养的iPSC。并加入一毫升蛋白水解和胶原溶解混合物。将培养皿在 37 摄氏度下孵育两分钟以分离细胞。
接下来，加入1.5毫升预热的iPSC培养基以停止反应。通过上下移液7至10次将细胞从细胞培养皿中解离以获得单细胞悬浮液。将细胞悬液转移到15毫升锥形离心管中。
在室温下以200xg沉淀细胞五分钟。并吸出上清液。将沉淀重悬于补充有50微摩尔Y27632的两毫升iPSC培养基中。
现在，使用10微升细胞悬液使用Neubauer室对细胞进行计数。使用补充有50微摩尔Y27632的iPSC培养基将细胞悬液的浓度调节至每150微升9， 000个细胞。为了产生胚状体或EB，在将150微升细胞悬液接种到超低附着96孔板的每个孔中之前，摇动细胞悬管以防止细胞沉降。
在潮湿的气氛中培养EB48小时。在孵育结束时，每孔除去100微升培养基。并加入150微升不含Y27632的预热新鲜培养基。
通过将封口膜网格放在 0.2 毫升管架上，纸封面朝上，在封口膜上创建一个四乘四的酒窝网格。并轻轻地将戴手套的手指按在每个机架孔上，以将EB嵌入基底膜基质中。然后取出纸张，用剪刀将酒窝网格从封口膜正方形中剪出，以调整其大小以适应 60 毫升的细胞培养皿。
将凹陷的封口膜放回0.2毫升管架上，为基底膜基质液滴的产生提供基础。使用带有切割的200微升移液器吸头的移液管小心地将EB从培养皿的孔中一个接一个地转移到封口膜酒窝中。将 16 个 EB 移动到网格后，取一个新的 200 微升移液器吸头并从酒窝中取出剩余的培养基。
现在，将一滴基底膜基质移液到每个含有一个EB的酒窝上。取一个 10 微升的移液器吸头，快速将 EB 移动到每个液滴的中心，而不会干扰液滴边界。将带有基底膜基质滴的凹陷封口膜放入60毫米细胞培养皿中。并在 37 摄氏度下孵育 15 至 30 分钟，以使基质聚合。
此外，要将基质嵌入的EB从封口膜中分离，请在培养皿中加入5毫升不含维生素A的分化培养基。并用镊子将封口膜方块倒置，使带有EB的一面朝向培养皿的底部。小心地摇动培养皿，从封口膜上分离含有EB的基底膜基质液滴。
如果其中一些仍然连接，请使用镊子将封口膜方块的边缘，并将其快速卷向盘子的中心多次。然后在55rpm的轨道振荡器上以55rpm的速度在加湿气氛中培养大脑类器官，其中含有5%二氧化碳和95%空气，温度为37摄氏度。将类器官保存在不含维生素A的DM中，每隔一天更换一次培养基。
显示了播种后 32 天的人类大脑类器官的明场图像，该类器官在外围具有心室样结构和紧凑、健康的形态。
