该协议展示了一种使用抗生素诱导和质谱法快速鉴定细菌蛋白的方法。该技术的主要优点是它的速度和简单性。样品制备简单。
该技术可以扩展到任何致病细菌的表征，例如毒力因子或抗生素耐药性，以更好地为细菌感染的适当治疗提供信息。首先，使用无菌的一微升环从LB琼脂平板上生长的单个菌落中收获细菌。并转移到含有300微升HPLC级水的2毫升O形圈环形线螺旋盖微量离心管中。
然后短暂涡旋管并通过离心沉淀细胞，在不锈钢MALDI靶标上的样品上清液的0.75微升遗物水中，并使其干燥。用用33%乙腈，67%水和0.2%三氟乙酸制备的0.75微升芥花酸饱和溶液覆盖干燥的样品斑点，并允许斑点干燥。一旦斑点干燥，将目标加载到质谱仪中。
打开采集软件，单击MS线性模式采集或质-电荷范围和质量-电荷下限和上限进入各自的场。单击马尔迪目标模板上要分析的样品点。然后按下鼠标左键，将光标拖到样品点上，以指定要为激光烧蚀或电离采样的矩形区域。
松开鼠标按钮开始采集，并为每个采样点收集1000张激光照。如果未检测到离子，则通过在激光强度下调整滑动比例尺来增加激光强度，直到检测到蛋白质离子信号。完成MS线性模式采集后，单击MS/MS反射器模式采集。
在"前体质量"字段中输入要分析的前体质量。接下来，在"前体质量"窗口中为前体质量的低质量侧和高质量侧输入隔离宽度（以道尔顿为单位）。单击"CID 关闭"按钮。
然后单击"亚稳压抑制器打开"按钮。如图所示，通过调整滑动比例尺，将激光强度调整到其最大值的至少90%。在 MALDI 目标模板上单击要分析的样品点，然后按下鼠标左键，将光标拖动到样品点上以指定要采样以进行激光烧蚀或电离的矩形区域，松开鼠标按钮以启动采集，并为每个样品点收集 10， 000 个激光镜头，如图所示。
双击蛋白质生物标志物寻求者可执行文件，将出现图形用户界面窗口。在成熟蛋白质质量字段中输入蛋白质生物标志物的质量，在质量耐量字段中输入质量测量误差。或者，单击"免费 b/y 离子蛋白质质量计算器"按钮，从假定的免费片段离子对中计算蛋白质质量，将出现蛋白质质量计算器工具的弹出窗口。
输入假定的互补片段离子对的质荷比，单击"添加对"按钮，将出现计算器蛋白质质量。将此值复制粘贴到成熟蛋白质质量字段中，然后关闭蛋白质质量计算器工具窗口。单击"设置残留限制"框。
选择终端信号肽长度，将出现带有滑动刻度和光标的弹出窗口，并将光标移动到所需的信号肽长度。如果未选择信号肽长度，则软件将执行无限制的序列截断。在"片段离子条件"下，通过单击一个或多个残基，D-E-N和/或P的框来选择多肽骨架切割的残基，然后单击输入片段离子加一搜索按钮，将出现弹出片段页面。
接下来，单击"添加片段离子"按钮，对于要输入的每个片段离子，将出现一个下拉字段。输入碎片离子的质量电荷比及其按电荷容差的相关质量。然后单击"保存并关闭"按钮。
在"需要匹配多少个片段离子"的右侧框中，滚动以选择必须匹配以进行鉴定的最小片段离子数，然后选择处于氧化状态的半胱氨酸残基。如果在搜索后未鉴定蛋白质，则用处于还原状态的半胱氨酸重复搜索。在"文件设置"下，单击"选择 FASTA 文件"图标以浏览并选择包含先前构建的细菌菌株的硅蛋白序列的 FASTA 文件。
然后选择输出文件夹并创建输出文件名。单击"对文件条目运行搜索"图标。将出现一个标题为"确认搜索参数"的弹出窗口，在启动搜索之前显示搜索参数。
如果搜索参数正确，请单击"开始搜索"。如果参数不正确，请单击取消并重新输入正确的参数。启动搜索后，参数窗口将关闭，并显示一个带有进度条的新弹出窗口，显示搜索进度和找到的标识数的运行计数。
完成搜索后，进度条将自动关闭，搜索摘要将显示在图形用户界面的日志字段中，并显示一个新的弹出窗口，显示发现的蛋白质鉴定。在目前的研究中，细菌培养物在LB中生长，具有两种不同浓度的霉素-C。细菌培养物的质谱以霉素-C浓度生长。
鉴定出冷休克蛋白C、冷休克蛋白E和功能不明的质粒传播蛋白。通过MS/MS分析9780处的未知蛋白离子，并用约100道尔顿的时间离子选择器窗口分离前体离子。质量为9675.9的片段离子是从9655处的亚稳态蛋白离子解离溢出的。
用于绞痛素E3的免疫蛋白的序列含有碱性残基可能的电离位点。从多肽主链裂解中检测到的片段离子，当在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时。N端蛋氨酸作为翻译后修饰被移除。
当细菌培养物在高菌霉素-C浓度下生长时，鉴定出细菌素的免疫蛋白。通过MS/MS分析了9651处的未知峰，并用零下75加60道尔顿的较窄且不对称的TIS窗口分离了前体离子。细菌素的免疫蛋白序列含有碱性残基可能的电离位点。
从多肽主链裂解中检测到的片段离子，当在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时。随着抗生素浓度的不同，相对蛋白质丰度可能会有所不同。这些是用质谱法分析的。
收获细菌细胞时，观察菌落形态和细菌生长与抗生素和浓度的关系。一微升的细胞环对于检测蛋白质是必要的。
