单纯疱疹病毒的生长、净化和滴定

肿瘤性疱疹单纯病毒是癌症免疫治疗的一种新兴形式。有效的病毒传播、净化和三位一体测定系统对于在实验研究中使用至关重要。这种方法非常简单，可在任何生物安全二级实验室环境中轻松采用，以获得高质量的病毒库存进行前科研究。

生产高质量、纯病毒性库存至关重要，因为它用于研究抗癌免疫反应，并开发一种基于病毒的新型癌症免疫疗法。此协议可用于净化任何野生类型或转基因疱疹简单病毒。对于从未执行过此技术的个人，此协议应易于阅读和遵循。

上市材料和试剂应在第一次尝试此技术之前就位。首先用两倍高的葡萄糖 DPBS 清洗 T-150 平方厘米的烧瓶，并辅以 1% IFCS。吸气 DPBS，每瓶添加 7 毫升病毒接种。

轻轻摇动烧瓶5分钟，在37摄氏度下孵育1.5至2小时。然后，取出接种，并在每个烧瓶中加入 25 毫升 DMEM，并辅以 1% IFCS。在37摄氏度和5%的二氧化碳孵化两到四天后，从每个烧瓶中收集20毫升培养超自然物，放入50毫升离心管中。

使用细胞刮刀，从烧瓶底部刮出细胞。将先前收集的培养超标物约 15 毫升添加到每个烧瓶中，使体积达到 20 毫升，然后使用 10 毫升无菌血清制液处理器轻轻清洗烧瓶底部几次。将中等体收集到放置在冰上的50毫升圆锥形离心管中。

在4摄氏度下，以300倍G分立管10分钟。将每个颗粒彻底补充到 1.25 毫升病毒缓冲器（VB）和 1.25 毫升以前收集的培养超自然物中。将所有重新喷出的颗粒混合到一个 50 毫升圆锥形离心机管中。

使用干冰和100%乙醇将再喷出的细胞冷冻，并储存在零下80摄氏度。在37摄氏度的温水浴中解冻先前的冷冻细胞，在水浴中三次循环发出声波。加入175单位的本佐纳塞核糖和两微升的两毫升氯化镁每毫升细胞裂解和涡流。

孵化30分钟后，在37摄氏度的温水浴中，将管子放在冰上。将细胞的利萨酸盐以300倍G旋转10分钟。在新的 50 毫升圆锥离心管中收集超细剂，并在 500 微升 VB 中重新注入细胞颗粒。指定它为弹丸一。

以 500 倍 G 再次旋转收集的超纳特 10 分钟，并将超纳特分别存放在新鲜的 50 毫升圆锥离心管中，以便以后使用。将细胞颗粒重新喷入VB的500微升中，指定为2粒。将重新喷出的颗粒一和颗粒二混合在一个新的1.75毫升离心管和涡流中，在水浴中两次发出声波，然后以400倍G旋转管10分钟。

从 1.7 毫升离心机管中收集超纳特，并与之前收集的 50 毫升圆锥离心管相结合。通过无菌的五微米PVDF膜过滤器将超自然体过滤成新的50毫米离心管，称为管一。将一毫升 VB 添加到 50 毫升离心机管中，在过滤前一步的超自然体涡流后排空，并通过放置在管一上的相同 PVDF 膜过滤器将其传递。

将过滤液从管一通过无菌 0.8 微米 MCE 膜过滤器放置在称为管二的新型 50 毫米离心管上。将一毫升 VB 添加到空管一个涡流中，并通过放置在管二上的相同 MCE 过滤器将其传递。将过滤液从管二通过无菌 0.45 微米 PVDF 过滤器放置在新的 50 毫升离心机管标记管三。

如前所述，重复用一毫升VB清洗管二，将过滤剂添加到管三。在这个具有代表性的分析中，在受感染细胞四舍五入后36小时、48小时和72小时，可以在Vero细胞中观察到细胞病变效应。随着时间的推移，CPE 水平的提高通过 mCherry 表达来明显可见。

感染后72小时，病毒斑块被X-gal染色，用 lacZ 表达可视化 oHSV。轻轻擦洗病毒感染细胞，轻轻清洗烧瓶底部，对于保持所有HSV受感染细胞完好无损，从而获得高滴定病毒存量至关重要。