这种方法可以通过检查宿主氨基反应中涉及的编码、非编码和病毒RNA表达以及病原体如何影响宿主的生物功能，帮助回答宿主-病原体相互作用研究中的关键问题。该技术的主要优点是，它提出了一个协议，从一个单一的全血样本中，从球蛋白减少的RNAseq库中对mRNA和非编码RNA进行处理。展示这项技术的将是莎拉·安德森，一个来自我实验室的技术员。
首先在50 20倍G下离心，在室温下离心10分钟。在生物安全柜中工作，在去除上经剂后，在颗粒中加入8毫升无RNase水。关闭管子，旋转颗粒，直到其明显溶解，然后在室温下以50 20倍G离心管10分钟，以回收颗粒。
在生物安全柜中工作，丢弃上一液并保存颗粒。要分离总RNA，首先将300微升的开液结合缓冲液移液到颗粒中。涡旋后，将混合物从每个管转移到新的标签1.5毫升离心管。
从 miRNA 隔离试剂盒中加入 30 微升的均质添加剂。旋转管子，放在冰上10分钟。在烟气罩中工作，从冰上取出管子，从试剂盒中加入300微升的酸酚氯仿试剂，并再次将涡流混合。
在室温下以10，000次G离心5分钟后，小心地将水相取出到新管中。根据上一步水回收量，将100%乙醇的体积添加到每个管和移液器中的水法植物中，加入1.25倍。准备每个样品包含滤芯的新鲜收集管。
将 675 微升的利沙酸乙醇混合物移液到滤芯上。以10，000倍G的短暂离心机将液体通过过滤器。丢弃流式。
重复将糖酸乙醇混合物添加到过滤器中并离心，直到完全使用。将 700 微升的清洗液从套件添加到滤芯中。短暂离心，将溶液拉过过滤器。
丢弃流式处理并保留相同的滤芯和收集管。在每个滤芯中添加 500 微升的洗涤液 2-3。再次离心后，丢弃流经并重复洗涤步骤。
要清除滤芯中残留的液体，请再旋转 60 秒。将墨盒转移到新鲜的收集管中。在每个滤芯的中心加入 100 微升 95 摄氏度的预热无核酸水。
以最高速度在桌面离心机上将墨盒离心约 20 到 30 秒。要预成型杂交与球蛋白减少寡糖，首先通过添加每个提取的样品到0.2毫升薄壁无核酸酶反应管RNA变性RNA。将管子放在 70 摄氏度的热循环器中两分钟。
之后，立即将管子放在冰上，以获得最佳的RNA质量。当管子冷却时，在两毫升管中准备 400 微升 10X 球蛋白还原寡糖混合物和 10X 寡糖杂交缓冲液。要进行杂交混合，加入6微克RNA样品，2微升10X糖蛋白还原寡糖混合物，一微升10X寡糖杂交缓冲液，将无核酸酶水最终体积10微升，以每0.2毫升薄壁、无核酸酶反应管。
将管子在 70 摄氏度的热循环器中放置两分钟。之后，立即将管子放在冰上。要执行 RNase H 消化，请先将 10X RNase H 稀释为一个 X RNase H，并带一个 X RNase H 缓冲液。
通过将两个10X RNase缓冲液的微升、一个RNase抑制剂的微升和一个X RNase H的两个微升和5个无核酸酶水的微升组合到总体积为10微升，准备RNase H反应混合物。将 RNase H 反应混合物加入 10 微升，加入球蛋白还原杂交样品并彻底混合。消化这种反应在37摄氏度10分钟，然后冷却到4摄氏度。
通过将一个0.5摩尔EDTA微升到管中，停止消化，将管内的全部内容转移到一个新鲜的1.5毫升管中。紧接着，添加80微升无RNase水，350微升的解液缓冲液，然后250微升的100%乙醇到每个管，通过移液混合。将每个 700 微升样品转移到单独的洗脱滤芯中，放入两毫升收集管中，以收集流经。
在 8，000 倍 G 或更高时离心 15 秒，然后丢弃流经。将相同的洗脱滤芯放入新的两毫升收集管中。要清洗滤芯膜，请将 500 微升的轻度洗涤缓冲液添加到滤芯中，并在 8000 倍 G 或更高电量下离心 15 秒。
丢弃流式。然后，使用相同的收集管，在滤芯中加入500微升80%乙醇。在8000倍及更高时离心两分钟。
丢弃流管和收集管，并保存洗脱旋转列。将每个洗脱旋转柱放入新的两毫升收集管中。全速离心五分钟，用滤芯上的打开盖干燥旋转柱膜，防止乙醇结转。
丢弃收集管后，将每个干燥的滤芯放入一个新鲜的 1.5 毫升收集管中。将 14 微升无 RNase 水直接添加到滤芯膜的中心。为了使RNA得到分离，请全速离心管60秒，然后继续进行RNA评估和制备。
球蛋白贫乏的样品现在可以分离，用于制备小型非编码RNA库以及核素贫乏mRNA和长期非编码RNA库。在使用本协议制备了球蛋白贫化和核素耗尽全血样本的表达库后，电泳文件运行摘要显示，一个具有 RNA 完整性编号为 6.3 到 9.2 的球蛋白贫乏库样本。与其他使用球蛋白耗竭方法且只能达到RIN数达到6位或接近6位的研究相比，这一发现是一个改进。
单个猪全血样本的减血前和球蛋白后减少表明，260至280纳米浓度比在或超过2。利用本协议，在汇集和测序之前，获得了球蛋白和核素耗尽全血mRNA库样品的基于芯片的电谱图。对于 mRNA 库，代表性电图在大约 280 个基对时具有峰值。
对于小型 ncRNA，基于芯片的电图包含大约 100 到 400 个基对的一系列峰值。大约 143 个基对的峰值对应于 miRNA，在大约 153 个基对的峰值对应于 piRNA。在尝试此过程时，重要的是要记住冰管立即注意到。
按照这个程序，其他方法，如下一代测序，应执行，以回答其他问题，如差异表达，表观遗传变化，以及他们对生物通路和过程的影响。不要忘记，使用苯酚氯仿试剂是极其危险的，应采取预防措施，如在烟罩工作。此外，在处理全血或传染性生物体时，应在活化传染性生物体之前在生物安全柜中进行工作。
