优化离 体 视网膜电图的设置和条件，以研究小眼睛和大眼睛的视网膜功能

该协议展示了在离体ERG中维持视网膜功能所需的条件，特别是由ON双极细胞产生的极其敏感的B波。使用离体ERG，我们可以以高信噪比测量不同类型的视网膜神经元的功能，同时允许轻松引入药物。该方法特别适合量化药物对视网膜功能和疾病的疗效。

首先，通过将离体ERG样品支架通过头级连接到差分放大器来转换多电极阵列设置。放大器必须插入多电极阵列系统接口板的模拟输入。使用多电极阵列的记录软件记录和存储来自离体ERG的输入数据。

将差分放大器的增益设置为100，并根据数字化仪规格增加额外的10倍电压放大。将低通滤波器设置为 100 赫兹。或者，要转换膜片钳设置，可通过上级将离体ERG样品支架连接到差分放大器，差分放大器必须连接到膜片钳放大器的头级。

使用膜片钳系统软件和数字化仪记录和存储来自离体ERG的输入数据。设置参数，如前所示。将具有适当波长的LED连接到显微镜。

要控制光刺激，请使用由数字化仪的模拟输出控制的LED驱动器。使用记录软件控制LED，该软件将触发光刺激。然后，使用光电二极管在标本支架中视网膜的位置校准LED的光输出。

如有必要，插入中性密度滤光片以调暗光路中的光强度。要准备电极，请将氯化银颗粒电极插入螺纹诱饵连接器中。用热胶填充诱饵连接器的内部，然后从无螺纹侧将一个两毫米的插座插入热胶中。

将 EP-1 电极的银线焊接到两毫米插座上。用螺纹上的O形圈将完成的电极拧入离体ERG样品支架的电极端口中。对于大眼睛，包括人类供体眼睛，清洁眼球中剩余的结缔组织并去除眼前段和晶状体。

使用手术刀从角膜缘切开约三毫米。将弯曲的解剖剪刀插入切口并沿着角膜缘切割，用晶状体去除眼睛的前部。获取视网膜标本进行离体视网膜电图检查，并用三到六毫米的一次性活检打孔。

要将组织安装在标本支架上，请将标本支架的下半部分放入一个大的培养皿中，并用含氧的 Ames'培养基填充它，使标本支架的圆顶刚刚被淹没。用细镊子小心地抓住视网膜的边缘，并将视网膜转移到离体标本支架的圆顶上，感光器面朝上。从艾姆斯溶液中取出标本支架，注意视网膜保持在原位。

完全干燥试样支架的板，以最大程度地减少噪声、电串扰和信号分流。然后用四个螺钉组装试样支架的两半并连接灌注管路。驱动样品支架下半部分的电极，并将阳极电缆连接到视网膜内侧，将阴极电缆连接到感光器侧。

每分钟至少用一毫升含氧的 Ames'培养基灌注标本支架 10 到 20 分钟，以使轻微反应稳定下来。离体ERG能够记录来自小鼠视网膜的感光器和ON双极细胞光反应。记录来自人类供体视网膜的光感受器反应是可能的，死后眼球摘除延迟长达5小时，ON双极细胞反应延迟不到20分钟。

在理想条件下，两种细胞类型的反应幅度和动力学随着时间的推移相对稳定，但在将视网膜安装在标本支架上40至45分钟后显示出缓慢下降。样品支架中的温度降低大大降低了光感受器和ON双极细胞的动力学。然而，它降低了B波的振幅，但没有降低A波的振幅。

相反，减慢灌注速率降低了光受体和ON双极细胞反应的振幅，但不影响A波或B波的隐含时间。停止灌注10分钟，然后再灌注导致ON双极细胞功能完全丧失，光感受器反应保留。足够的灌注速度和生理温度对于获得稳定的反应至关重要，特别是从离体ERG中的ON双极细胞。

该协议允许深入探索人类黄斑和外围光感受器功能的差异，回答以前只能在非人类灵长类动物中进行的问题。