这种易于执行的方案在高通量设置下的不同条件下评估各种噬菌体组合(也称为噬菌体混合物)的抗菌功效。该技术的主要优点是能够流出不同的生物和非生物因子,例如温度,这些因子可能会在一系列环境条件下影响噬菌体的功效。该方法可以促进设计适当的噬菌体混合物,以增强生物防治和治疗结果,并确定细菌宿主和噬菌体之间的相互作用。
首先,使用过滤的吸头设置微孔板测定,以避免交叉污染。首先,在96孔微孔板的1至12柱的孔中加入180微升mTSB,然后在无菌96孔微孔板的柱1至8中制备每个噬菌体的连续十倍稀释液以建立测定。将20微升单个噬菌体或噬菌体混合物加入微孔板顶排A的孔中1至8。
对于无噬菌体和空白对照,将20微升mTSB添加到9至12色谱柱的顶部孔中。移液时,将孔内容物与温和反复抽吸至少五次混合,并在稀释液之间更换吸头。从最后一排H中取出20微升,然后使用一毫升移液管将两到三毫升稀释的培养物转移到储液器中,为测试的细菌菌株建立储液槽。
使用多通道移液器,在1至10柱中向每个孔中加入20微升稀释的细菌培养物,同时在每次添加之间更换吸头。在37摄氏度下覆盖并孵育微孔板。每隔两小时,从培养箱中取出微孔板,并使用酶标仪读取板。
或者,将板孵育在酶标仪中,并随着时间的推移读取它。要使用酶标仪检查600纳米处的光密度,请在酶标仪上打开程序。在启动选项窗口中选择"简单模式",然后在"任务管理器"中选择"创建新协议"。
从"选择板类型"窗口中,从下拉列表中选择"96 孔板"。作为检测方法,为读取类型选择"吸光度",为光学类型选择"端点/动力学"选项,选择"单色器",然后单击"确定"。对于读取步骤,输入 600 纳米的波长,选择正常作为读取速度,然后单击 OK.To 设置测定的温度,单击"孵化"复选框,然后选择"培养箱打开"。在温度框中输入所需的温度,然后单击"确定"。单击 37 摄氏度孵育温度的"在继续执行下一步之前预热"复选框,尽管对于 22 摄氏度的测试条件,该选项不是必需的。要防止在孵育过程中板盖上结露,请在梯度框中输入一个值来设置温度梯度,然后单击"确定"。接下来,单击"动力学"复选框以打开动力学设置。
将运行时间设置为 10 小时(对于 37 摄氏度的孵育)或 22 小时(对于室温),并输入 2 小时作为读取间隔,然后单击"确定"。单击过程窗口中的"摇动"复选框以设置摇动条件(如果每次动力学读取都需要)。选择"线性"作为摇动模式,并将持续时间更改为 30 秒。将线性频率值设置为每分钟731个周期,然后单击 OK.In"实验方案摘要对话"窗口,单击"板布局",选择"空白"、"测定对照和样品",然后单击"下一步"。
定义每个孔类型的设置后,单击"完成"。在左侧界面中选择一个孔ID,将其分配给"板布局"窗口中显示的矩阵,然后单击"确定"。单击"读取印版"按钮,将协议另存为 prt 文件,然后单击"保存"。插入板,然后单击确定。实验完成后,将实验另存为 xpt 文件,然后单击"保存"。
通过单击消息窗口框中的"是"按钮将数据导出到 Excel,以进行进一步分析。单击"保存是/否"选项和"不再询问"复选框以保存首选项。在方案之后,对噬菌体功效与各种噬菌体组合,温度,时间和感染的多样性或MOI进行了比较。
基于该分析,在22摄氏度下孵育14,16或18小时后,抗O157噬菌体功效最大化。为了了解细菌的噬菌体杀伤动力学,根据采样时间,MOI和噬菌体处理绘制了600纳米处的OD值。显示了处理过的37摄氏度时具有代表性的细菌生长曲线。
即使在低MOI下,T4在每次采样时也完全抑制了细菌的生长。为了分析噬菌体抑制细菌生长,将所有MOI的平均OD值与每个采样时间和噬菌体处理绘制在一起。两个温度下的代表性图表显示,例如,T1加T4的噬菌体杀灭功效在22摄氏度时比37摄氏度时增强。
显示了总体噬菌体有效性的比较,这有助于确定最佳的相治疗。例如,对于大肠杆菌菌株3081,用噬菌体T4和T5加T4处理是在37摄氏度下最有效的处理。然而,在22摄氏度时,除T4外,噬菌体T1加T4,T1加T4加rV5和四种噬菌体鸡尾酒是有效的。
在执行该程序时,极其精确的移液,特别是当使用多通道移液器和方法的均匀性对于获得可比较和可解释的结果至关重要。需要后续实验来评估最具影响力的鸡尾酒在筛选中的进一步表现,防止在广泛的肉汤培养系统和其他生物基质中出现抗噬菌突变体。