使用单细胞荧光成像对菌际竞争进行量化

该方法旨在通过单细胞水平细菌菌株之间的 VI 型分泌系统量化接触依赖性竞争。该技术使用全细胞面积而不是细胞计数来量化细菌竞争，使研究人员无需使用专有的图像分析软件即可轻松。这种方法可以很容易地修改，以量化不同品种的可培养微生物之间的竞争。

此外，实验设置可以优化，用于直立或倒置显微镜。首先，通过将 2% 低熔化的玫瑰溶解成海洋 PBS 来准备玫瑰垫溶液。在微波炉和漩涡中短暂加热溶液约 30 秒，直到玫瑰完全溶解。

将此溶液保存在 55 摄氏度的水浴中，直到准备好使用。接下来，将一块实验室胶带包裹在玻璃滑梯上五次。在同一幻灯片上重复包装胶带，使两个胶带片之间的距离略小于盖唇宽度。

为了确保平坦的玫瑰垫表面，移液器在两片胶带之间加热气垫溶液，并立即在上面放置盖片，使盖片与液体接触，并推出任何气泡在玫瑰溶液中。让玫瑰垫在室温下凝固至少一小时。然后用剃须刀刀片将此玫瑰垫切成四个 5 平方毫米垫，用于成像。

为了准备共同孵化的菌株，将冷冻库存中的每一株菌株排到 LBS Agar 板上，辅以适当的抗生素，并在 24 摄氏度下过夜孵育。第二天，从每个菌株中挑选两个菌落，并在抗生素补充的LBS介质中重新填充菌落。在24摄氏度的高温下，在一夜之间孵化重新沉着的殖民地，以每分钟200次的旋转摇晃。

第二天早上，亚文化每个生物复制一到1000倍新鲜LBS介质没有抗生素和孵化，直到细胞达到约1.5在600纳米的光学密度。测量并记录所有样品的光学密度为 600 纳米。通过稀释 LBS 介质将每个样品的光学密度标准化为光学密度。

将两个相互竞争的菌株以相等的比例混合，将每个规范化菌株的 30 微升添加到标有 1.5 毫升的管中。漩涡混合应变培养一到两秒钟。混合每个生物复制和治疗的相互竞争的菌株，共产生四个混合菌株管。

通过离心将每个混合培养物集中三倍，以确保在共同孵化过程中有足够的密集竞争细胞进行接触依赖性杀灭。丢弃超高分子，在LBS介质的20微升中重新使用每个颗粒，并为每个样品执行浓度程序。如果在倒置显微镜上成像，首先在 35 毫米培养皿的 1.5 号盖片底部发现混合培养的两个微升，并将阿加罗斯垫放在共同孵化点上。

在玫瑰垫上放置一个12毫米的圆形玻璃盖唇。重复发现和放置其余三种混合文化的盖唇，这将导致四个菜肴的图像。在继续前行之前，让幻灯片在长凳顶部坐大约五分钟，让细胞在护垫上安顿下来，以避免在成像过程中移动。

首先，关注使用 DIC 的细胞，以最大限度地减少光出血效应。根据单个细菌细胞的平均大小，使用 100 倍的油目标。以最少的背景检测调整每个通道的曝光时间和采集设置。

选择至少五个视图字段，并在每个适当的通道中获取图像。打开图像分析软件并导入要分析的图像文件。将图像转换为灰度，分离通道，首先对预处理图像进行阈值并创建二进制掩码。

选择分析，然后从下拉菜单，选择设置规模，并输入显微镜设置的适当值。接下来，请前往设置测量并选择区域。在分析选项卡下，使用默认设置选择分析粒子。

如果样品中存在碎片，可以调整大小或圆形以过滤掉非细胞颗粒。选择显示，然后大纲，以便过滤出来分析的输出将包括所有粒子分析的数字轮廓。将测量结果导出到电子表格软件中，以便进一步分析和绘制。

显示了每个实验治疗的代表性荧光图像。在发现之前集中混合培养，导致圆润或消失的目标细胞超过两个小时，表明成功抑制。当混合培养不集中时，细胞仍然分散在幻灯片上。

如果没有足够的细胞对细胞接触，目标菌株不会受到致命菌株的抑制。目标细胞在拥挤或分散的条件下与 T6SS 突变体共同孵育时，既不会消失，也不会变圆。因此，目标在任一治疗中都不受约束。

对目标菌株和抑制剂菌株进行了粒子分析结果的绘制和分析。在最终时间点超过初始目标面积的 100% 表示目标净增加，低于初始目标面积的 100% 表示目标净减少。抑制剂菌株的净生长在所有治疗中都观察到。

然而，与所有其他治疗方法相比，野生型抑制剂在拥挤的条件下与靶点共同孵育时，抑制剂菌株初始面积的百分比显著高于该靶点。为了获得清晰的图像，玫瑰垫需要尽可能平坦。在将胶带包裹在幻灯片上之前，先切开胶带，以确保它们长度相同。