基于人类原发性皮肤成纤维细胞的亨廷顿舞蹈症模型微管加端动力学可视化

亨廷顿舞蹈症HD是一种无法治愈的神经退行性病理学，由编码亨廷顿蛋白的基因突变引起。亨廷顿蛋白主要与囊泡和微管有关，可能参与微管依赖性运输过程。为了研究突变亨廷顿蛋白对微管活力的影响，我们使用EB3蛋白的体内可视化，通过弯曲和稳定生长的正端来调节微管的动态特性。

为了将荧光标记的EB3加载到人皮肤成纤维细胞中，我们应用了质粒转染。我们使用原代成纤维细胞培养物从EB3患者的皮肤活检中获得本研究。在几小时内将活检用DMEM培养基送至实验室，补充每毫升青霉素15微克，每毫升链霉素50单位。

将活检组织与少量培养基一起放入六厘米培养皿中。使用无菌手术刀，将活检样本切成约0.5至1毫米大小的碎片。将一个，两个获得的碎片放入3.5厘米的培养皿中，并在活检片上放置无菌盖玻片。

慢慢加入1.5毫升生长培养基。在CO2培养箱的生长培养基中培养纤维塑料，在5%CO 2中，即7摄氏度，80%湿度。四，七天后，首先是角质形成细胞，然后成纤维细胞开始从组织迁移到培养皿的底部。

细胞培养。对于转染可视化，应使用玻璃共聚焦板培养皿，共聚焦培养皿。用蒸馏水制备的高压灭菌的0.1%明胶溶液盖住盘子底部。

孵育 15 分钟。准备培养基。充分混合，储存在4摄氏度以上。

将培养基加热至37摄氏度，然后加入细胞。在显微镜下评估培养物。取出培养基，并用无菌DPBS洗涤细胞。

向细胞中加入一毫升预热的0.25%胰蛋白酶溶液。在显微镜下检查细胞是否完全脱离底物。用一毫升培养基使胰蛋白酶失活。

将细胞悬浮液转移到15毫升的锥形管中。将管以200 G离心五分钟。除去上清液，将细胞调色板重悬于一毫升培养基中。

计算单元格编号。计算所需的单元格数。用8到15的密度将它们去种子，乘以10到3的幂，经过一厘米。

将其平移到培养基的毫升中。从准备接种的培养皿中取出明胶溶液，并立即加入两毫升细胞悬浮液。在CO2培养箱中以37摄氏度培养成纤维细胞。

每两、四天刷新一次培养基。对于实验，使用4个，11个传代的细胞。到转染时，汇合处应不超过70，80%在转染前24小时用新鲜的培养基替换培养基。

根据细胞接种的面积和密度制备DNA-脂质复合物。脂质体转染剂，并将细胞接种的密度乘以10到4个细胞的幂，用一厘米递过。将三微升商用试剂加入125微升Opti-MEM中，不含抗生素。

不要接触管壁，轻轻重悬。稀释质粒DNA，GFP-EB3，将一微克质粒DNA加入125微升OptiMEM中。轻轻重悬。

将稀释的质粒DNA加入到稀释的转染试剂的每管中，比例为一比一。孵育 30 分钟。将DNA脂质复合物加入带有细胞的六厘米培养皿中。

与十字形摆动混合30秒。用转染剂孵育细胞24小时，然后将培养基换成新鲜培养基。在24和48小时内分析检查后的效率。

准备成像。在细胞活体成像之前，将培养基更换为没有PH指示剂染料的培养基，以减少自发荧光。小心地将矿物油涂抹在介质的细胞相上，以完全覆盖介质，将其与外部环境隔离，以减少O2渗透和介质蒸发。

使用微距灯和所有图像在60倍，100倍物镜中拍摄，具有高数字光圈拍摄图像。对于在viva观测中，显微镜必须配备培养箱以保持细胞的必要条件，包括击中光学台，并且透镜通过37摄氏度，封闭室供应CO2，以及湿度水平支持。在成像之前，将共聚焦培养皿与细胞一起置于显微镜的支架中。

确保碟形天线和相机牢固地固定在支架上，以避免在拍照时漂移。设置成像参数。选择低暴露值，因为载玻片诱导细胞损伤，与氧气空间反应。

为了研究人类皮肤成纤维细胞中微管的动力学，我们选择了300毫秒的暴露。专注于感兴趣的对象。对于长时间的延时成像，自动对焦稳定系统，完美的对焦系统是必要的，因为沿设定轴可能会有偏移，因此感兴趣的物体将失焦。

根据电池的光敏性和耀斑铬褪色的速率，选择最佳成像条件。由于微管是高度动态的结构，因此可以选择相当短的时间，并且帧速率必须足够高。为了研究皮肤成纤维细胞中的微管动力学，我们使用每秒一帧的频率，持续三到五分钟。

当选择下一个物体获取图像时，请远离已经成像的区域，因为在光线的影响下，存在可忽略的光出血。由于我们使用的成像频率相对较高，因此快门在图像之间没有关闭，并且灯在整个成像期间都迟到了，并且褪色增加。选择最佳视频，以直观地研究微管动力学，同时考虑转染质量，微管图像的质量，最佳信噪比以及分析细胞的无漂移。

使用选定的视频来研究微管加端动力学，方法是在斐济计划中桁架它们。方案中最关键的步骤是转染，确保足够的蛋白表达。良好的信噪比、无微管光漂白以及无细胞漂移对于成像至关重要。

微管动力学的体内可视化提供了关于突变亨廷顿蛋白特性的重要信息。我们的方案可以应用于其他疾病的研究，其病理学涉及细胞骨架的动态特性。