由于肺宿主非常复杂和独特的免疫系统，因此已经开发并报告了几种用于识别肺免疫细胞的门控策略。由于存在几种不同的方法，因此很难比较不同实验室产生的结果。我们的门控策略提供了一种全面且可重复的方法，使用九种标志物鉴定多达12种不同的肺髓样和非髓系免疫群体。
本方案描述了稳态条件下肺免疫群体的表征和鉴定。然而，该协议可用于识别各种疾病模型中这些细胞群的变化，其中它可以帮助识别肺免疫景观的疾病特异性变化。首次使用这种技术的研究人员应该注意消化条件和试剂，因为它们对免疫细胞从肺组织中的释放有很大的影响。
首先准备安乐死动物进行手术。通过在四肢上使用针头或胶带来稳定小鼠背侧，然后使用70%乙醇对腹侧区域的皮肤进行消毒。从颈部到腹部做一个切口。
从胸部区域去除皮肤，以及肋骨和胸骨。使用18至21号针将10毫升冷PBS注射到右心室中，直到它们完全变白，从而冲洗肺部。然后，切除胸腺和心脏而不接触肺部。
将肺与周围组织分离，并将其转移到含有冷BSA缓冲液的管中。将肺转移到培养皿中，用两把细手术刀切碎，然后将其放入50毫升的锥形管中。加入五毫升消化缓冲液以洗涤平板。
盖上管盖，在37摄氏度下以每分钟150次旋转的速度在眼眶摇床上消化肺部30分钟。通过加入10毫升冷BSA缓冲液停止反应。消化后，使用18号针头混合并溶解肺片。
将70微米过滤器放在新的50毫升锥形管的顶部，并将消化的肺混合物转移到过滤器中。使用10毫升注射器柱塞的橡胶侧粉碎过滤器上剩余的肺片，并用BSA缓冲液清洗。在7摄氏度下以350 G离心单细胞悬浮液八分钟。
弃去上清液并将细胞重悬于一毫升ACK裂解缓冲液中。使用一毫升移液管混合悬浮液，并在室温下孵育90秒。向反应混合物中加入10毫升冷的BSA缓冲液，并在4摄氏度下以350 G离心7分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬于染色缓冲液中，并使用血细胞计数器计数细胞。以每毫升500万个细胞的浓度重悬细胞以进行表面染色。将每孔200微升中的100万个细胞转移到96孔板中，并在4摄氏度下以350 G离心板7分钟。
通过在染色缓冲液中稀释抗1632抗体来制备流式细胞术阻滞溶液。将细胞重悬于50微升流式细胞术阻断溶液中。将悬浮液在4摄氏度或冰上孵育15至20分钟。
然后，向板中加入150微升染色缓冲液，并在4摄氏度下将其350G离心五分钟。通过稀释染色缓冲液中的表面抗体来制备表面抗体溶液。将细胞重悬于50微升的表面抗体溶液中，并在黑暗中以4摄氏度孵育板。
然后，用染色缓冲液洗涤细胞两次。通过混合三组份固定和透化稀释剂和一份染色缓冲液来制备固定和透化缓冲液。将细胞重悬于96孔板每孔孔的50微升制备缓冲液中，并在黑暗中以4摄氏度孵育20至25分钟。
用纯化的去离子水稀释透化缓冲液，制备一次透化缓冲液，并用它来洗涤细胞。通过用一毫升通透缓冲液稀释来制备细胞内抗体溶液。将细胞重悬于96孔板每孔50微升稀释的细胞内抗体溶液中，并在黑暗中以4摄氏度孵育40分钟。
用透化缓冲液洗涤细胞，然后用染色缓冲液洗涤细胞。最终洗涤后，将细胞重悬于200微升染色缓冲液中。在流式细胞仪上采集每个样品至少150万个细胞。
在手术成功和适当的术后手术后，通过门控策略排除了碎片和双层。通过流式细胞术使用CD45 +造血标记物鉴定免疫细胞。这些细胞被区分为活的或死的。
免疫肺细胞使用抗GR-1和抗CD68抗体分为三组。使用Ly6G作为唯一标记物鉴定和验证中性粒细胞。CD45 +群还含有自然杀伤细胞，T细胞和B细胞。
这些细胞通过自然杀伤1.1，CD3和B220抗体染色和验证。支气管肺泡灌洗物鉴定出CD11b标志物阳性的嗜酸性粒细胞，以及不表达高水平CD11b的肺泡巨噬细胞。
这些细胞对CD103和CD11b标志物表现出阳性或阴性反应。CD103阴性细胞根据CD64表达分为常规和单核细胞来源的树突状细胞。单核细胞来源的树突状细胞CD24树突状标志物阳性率低，CD64泛巨噬细胞标志物阳性。
基于CD64和GR-1表达对具有经典和非经典单核细胞的间质巨噬细胞进行区分。这些细胞对CX3C趋化因子受体一的表达呈阳性。该过程中最重要的步骤是适当的组织收获，消化和单细胞悬浮液的制备，以及对活细胞和单线态的门控。
除了通过流式细胞术表征肺的免疫细胞外，还可以在分离的细胞群中进行细胞培养和功能测定。这项技术可以为研究人员探索肺部疾病的新问题铺平道路，例如感染，自身免疫性疾病和癌症。
