神经嵴细胞从胚胎中的颅神经褶皱迁移或放置在培养物中时。这提供了一种无需细胞解离即可分离原代迁移神经嵴细胞的便捷方法。虽然神经嵴迁移通常发生在三维胚胎环境中，但二维培养能够可视化和研究与迁移相关的过程。
尽管存在颅神经折叠培养方案，但这种方法需要训练和生物体特异性步骤。该视频演示了促进鸡颅神经褶皱培养物可重复制备的技术。初学者经常难以解剖和电镀神经褶皱并评估培养结果。
遵循解剖指南并应用此处描述的形态测量分析可以获得一致的定量结果。首先，将受精卵直立放置在 38 摄氏度的加湿培养箱内。从孵化器中取出鸡蛋后，彻底喷洒 70% 乙醇并使其干燥，对蛋壳进行消毒。
为了固定和染色培养物，使用放入多孔组织培养皿中的玻璃盖玻片，并移取足够的纤连蛋白溶液以覆盖孔底。接下来，盖上盖子，将板与纤连蛋白溶液在 38 摄氏度的加湿培养箱中孵育至少一小时，同时解剖神经褶皱。用钝镊子在蛋壳上戳一个小孔，长度为鸡蛋长度的 1/4 到 1/3。
小心地将钝镊子插入小孔中，确保不会破坏蛋黄。然后，切开鸡蛋周围的蛋壳，去除蛋壳的顶部，并将胚胎定位以进行隔离。使用闭合的钝钳的平坦边缘轻轻擦去覆盖胚胎的蛋黄表面上的任何多余白蛋白，以准备胚胎。
使用镊子将滤纸支撑架放在胚胎上，胚胎在框架的窗口中。轻轻按下滤纸以粘附在蛋黄上。用解剖剪刀在滤纸框架的外侧剪开。
用镊子或剪刀尖抓住框架的边缘，轻轻地将胚胎从蛋黄上抬起。将胚胎与纸框面朝下放入装有带笔链球菌的林格氏培养皿中。如果收集胚胎用于RNA或蛋白质敏感的下游应用，请将胚胎放在冰上。
将胚胎转移到含有林格笔链球菌溶液的干净培养皿中。轻轻地来回漱口胚胎以清除任何遮挡视线的蛋黄，并更换林格氏笔链球菌溶液，或者在它变得浑浊时将其转移到新鲜的盘子中。将胚胎背侧和框架面朝上放置在解剖显微镜下。
将胚胎留在纸架上，使其拉伸并保持到位。然后，去除卵黄碱膜，用镊子暴露神经褶皱。包括组织尾部至扩张的视囊泡和喙部至后脑，其中菱形收缩刚刚开始出现。
使用弹簧剪刀，小心地切除中脑神经褶皱。注意切除神经褶皱的最背侧，尽量减少对神经管和非神经外胚层的污染，并使用 P20 移液器或无菌玻璃巴斯德移液管将神经褶皱转移到含有林格氏笔链球菌溶液的干净培养皿中，用卵黄林格笔链球菌溶液冲洗。将收集的褶皱存放在冰上，同时解剖其他褶皱。
从培养箱中取出培养皿后，使用移液器或巴斯德移液器从盖玻片、培养皿或孔中取出纤连蛋白溶液。用林格笔链球菌溶液冲洗纤连蛋白包被的底物后，将适量的完整培养基添加到培养皿或孔中。为了阻挡塑料并防止纸巾粘连，请使用 P20 或 P200 移液器，并用蛋黄林格笔链球菌溶液冲洗移液器吸头。
然后，将分离的神经褶皱转移到纤连蛋白包被的盖玻片的中心，注意尽可能少地转移林格氏笔链球菌溶液。让外植体沉淀 10 到 15 分钟后，通过缓慢而小心地携带带有镀神经褶皱的培养皿，将它们放入 38 摄氏度的加湿室中。用巴斯德移液管取出培养基，并用过滤灭菌的PBS冲洗孔。
加入4%多聚甲醛，在室温下将其放在平台摇床上15分钟。孵育结束时，除去多聚甲醛，用PBS冲洗孔三次，并加入含有5%血清的PBST。现在，将 30 微升 200 纳摩尔俄勒冈绿共轭鬼笔环肽移液到每个盖玻片的光滑表面上。
使用一对镊子，从含有5%血清的PBST上取下盖玻片，确保细胞朝上的方向。将盖玻片的边缘短暂接触到精致的任务刮水器上，以吸掉多余的液体。轻轻地将每个盖玻片面朝下放在稀释的鬼笔环肽滴上，并在室温下孵育30分钟。
孵育期结束后，从染色溶液中提起盖玻片并将其放回培养皿中，将其翻转，使细胞侧朝上。确保用PBST盖住盖玻片，并将其放在平台振动器上10分钟，保持盖玻片盖住并在黑暗中。取出 PBST，然后重复清洗盖玻片两次，总共清洗三次 10 分钟。
将一滴封片剂放在显微镜载玻片上。通过将盖玻片以一定角度缓慢降低到安装介质上，以避免产生气泡，并在成像前让盖玻片面朝下安装，并让介质在成像前凝固。最后，对染色的细胞进行成像，并将其导出为TIFF文件。
神经嵴细胞在孵育后三到四个小时内开始从贴壁神经折叠外植体中出现，并在大约20小时后完成迁移。使用HNK-1标记迁移神经嵴细胞，大多数细胞似乎是HNK-1阳性。通过用鬼笔环肽染色丝状肌动蛋白来观察迁移的神经嵴细胞。
使用ImageJ处理鬼笔环肽染色细胞的图像以产生阈值图像，其中细胞显示为黑色，背景为白色。分析阈值图像，并以对比条形图或小提琴图显示各种测量值。例如，分析的69个细胞的平均面积约为802.11平方微米，范围从60.27到2， 664.53平方微米。
圆度反映了细胞的突起度，范围从 0.101 到 0.875。较低的值表示细长的形状，而值 1 表示完美的圆形。大多数细胞表现出细长的形状，这在小提琴图中最容易看到。
该领域的迁移性神经嵴细胞的平均长宽比约为2.13，长宽比为1表示对称形状。仔细切除和外植体板对于成功的培养至关重要。让神经褶皱面朝下沉降 10 到 15 分钟，然后慢慢转移到培养箱中以鼓励粘附。
这些技术的变化包括培养前的瞬时遗传操作和孵育期间的延时成像。此外，该协议允许收集迁移和迁移神经嵴细胞群以进行组学水平分析。
