As células da crista neural emigram de dobras neurais cranianas em embriões ou quando colocadas na cultura. Isso fornece um método conveniente para isolar células primárias de crista neural migratória sem dissociação celular. Enquanto a migração de crista neural normalmente ocorre dentro do ambiente embrionário tridimensional, a cultura bidimensional permite a visualização e investigação de processos relacionados à migração.
Embora existam protocolos de cultura de dobra neural craniana, este método requer treinamento e passos específicos do organismo. Este vídeo demonstra técnicas para facilitar a preparação reprodutível de culturas de dobra neural craniana. Os iniciantes muitas vezes lutam com dissecar e emplacar dobras neurais e avaliar os resultados da cultura.
Seguindo as diretrizes de dissecção e a aplicação da análise morfométrica descrita aqui permite a obtenção de resultados quantitativos consistentes. Para começar, coloque os ovos fertilizados em posição vertical dentro de uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius. Depois de remover os ovos da incubadora, desinfete as conchas pulverizando completamente 70% de etanol e deixando-as secas.
Para fixação e coloração das culturas, use deslizamentos de tampa de vidro colocados em um prato de cultura de tecido multi-poço, e solução de fibronectina de pipeta suficiente para cobrir o fundo do poço. Em seguida, substitua a tampa e incuba a placa com solução de fibronectina em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius por pelo menos uma hora enquanto disseca dobras neurais. Use fórceps contundentes para fazer um pequeno furo na casca de 1/4 a 1/3 do comprimento do ovo.
Insira cuidadosamente os fórceps contundentes no pequeno orifício, garantindo que não interrompam a gema. Em seguida, corte a casca de ovo ao redor do ovo, remova a parte superior da casca de ovo e posicione o embrião para isolamento. Prepare o embrião usando suavemente a borda plana de fórceps fechados para limpar qualquer excesso de albumina na superfície da gema cobrindo o embrião.
Use fórceps para colocar uma estrutura de suporte de papel filtro sobre o embrião, com o embrião na janela do quadro. Pressione suavemente o papel do filtro para aderir à gema. Corte ao redor da parte externa do quadro de papel do filtro com uma tesoura de dissecção.
Use fórceps ou pontas de tesoura para agarrar a borda da armação e levante suavemente o embrião para longe da gema. Coloque o embrião com o lado da moldura de papel para baixo em uma placa de Petri de 60 ou 100 mililitros cheia de Ringer com estreptococos de caneta. Mantenha o prato de embriões no gelo se colecioná-los para uma aplicação a jusante sensível à proteína ou sensível à proteína.
Transfira um embrião para um prato limpo contendo a solução de estreptococos de caneta de Ringer. Gentilmente swish o embrião para frente e para trás para limpar qualquer gema que obscurece a vista, e trocar a solução de pen-estreptococos do Ringer ou transferi-lo para um prato fresco se ficar nublado. Posicione o embrião dorsal e armar o lado para cima sob um microscópio dissecando.
Deixe o embrião na moldura do papel para mantê-lo esticado e mantido no lugar. Em seguida, remova a membrana vitelline, usando fórceps para expor as dobras neurais. Inclua tecido caudal para as vesículas ópticas em expansão e rostral para o cérebro traseiro, onde constrições de rommbomere estão apenas começando a aparecer.
Usando tesouras de mola, extirbra cuidadosamente as dobras neurais do cérebro médio. Tome cuidado para extirver o aspecto dorsal-mais da dobra neural com contaminação mínima do tubo neural e ectoderme não-neural, e transfira as dobras neurais para um prato limpo contendo a solução de estreptococos de ringer usando um pipettor P20 ou um copo estéril Pasteur pipeta enxaguado com solução de estreptococos de caneta de ringer. Armazene dobras coletadas no gelo enquanto disseca dobras adicionais.
Depois de remover o prato de cultura da incubadora, use uma pipettor ou pipeta Pasteur para remover a solução de fibronectina de deslizamentos de cobertura, prato ou bem. Depois de enxaguar o substrato revestido de fibronectina com a solução de pen-estreptococos de Ringer, adicione um volume apropriado de mídia de cultura completa ao prato ou bem. Para bloquear o plástico e evitar que o tecido grude, use um pipettor P20 ou P200 e enxágue a ponta da pipeta com a solução de estreptococos de caneta do Ringer.
Em seguida, transfira as dobras neurais isoladas para o centro da tampa revestida de fibronectina, tomando o cuidado de transferir o menor solução de pen-estreptococos de Ringer possível. Depois de permitir que as explantas se contentem por 10 a 15 minutos, coloque-as em uma câmara umidificada a 38 graus Celsius, carregando lentamente e cuidadosamente o prato de cultura com dobras neurais banhadas. Remova a mídia de cultura com uma pipeta Pasteur e enxágue os poços com PBS esterilizado por filtro.
Adicione 4% de paraformaldeído, e mantenha-o em um agitador de plataforma por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, remova o paraformaldeído, enxágue os poços três vezes com PBS e adicione PBST contendo 5% de soro. Agora, pipeta 30 microliters de 200-nanomolar Oregon Green conjugado phalloidin em uma superfície lisa para cada deslizamento de cobertura.
Usando um par de fórceps, remova o deslizamento de tampa do PBST contendo 5% de soro, garantindo a orientação das células voltadas para cima. Descarra o excesso de líquido tocando brevemente a borda do deslizamento da tampa para um delicado limpador de tarefas. Coloque suavemente cada lado da célula de deslizamento de cobertura para baixo na gota de faloideína diluída, e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após o período de incubação, levante o deslizamento da tampa da solução de coloração e coloque-o de volta no prato de cultura, virando-o para que o lado da célula seja para cima. Certifique-se de cobrir o deslizamento de tampa com PBST, e coloque-o em um agitador de plataforma por 10 minutos, mantendo os deslizamentos de cobertura cobertos e no escuro. Remova o PBST e repita a lavagem dos deslizamentos de tampa duas vezes para um total de três lavagens de 10 minutos.
Coloque uma gota de mídia de montagem em um slide de microscópio. Monte o lado da célula de deslizamento de tampa para baixo, baixando lentamente o deslizamento da tampa em um ângulo para a mídia de montagem para evitar a criação de bolhas e permitir que a mídia se ajuste antes da imagem. Finalmente, imagem as células manchadas e exportá-las como arquivos TIFF.
As células da crista neural começaram a emergir de explanações de dobra neural aderente dentro de três a quatro horas de incubação, e a migração foi concluída após aproximadamente 20 horas. As células da crista neural migratória foram rotuladas usando HNK-1, e a maioria das células parecia ser HNK-1 positiva. As células de crista neural migradas foram visualizadas pela coloração de atin filamentoso com fábula.
Imagens das células manchadas de falo foram processadas usando ImageJ para produzir uma imagem limiar na qual as células pareciam negras com um fundo branco. A imagem limiar foi analisada e várias medidas exibidas em gráficos de barras contrastantes ou gráficos de violino. Por exemplo, a área média das 69 células analisadas foi de aproximadamente 802,11 micrômetros quadrados, variando de 60,27 a 2, 664,53 micrômetros quadrados.
A circularidade reflete a saliência da célula e varia de 0,101 a 0,875. Os valores inferiores indicam uma forma alongada, enquanto um valor de um indica um círculo perfeito. A maioria das células exibia uma forma alongada, que é mais facilmente vista na trama do violino.
As células de crista neural migratória neste campo tinham uma proporção média de aproximadamente 2,13, e uma proporção de uma indica uma forma simétrica. Excisão cuidadosa e design de explant são cruciais para culturas bem sucedidas. Permita que as dobras neurais se acalmem de 10 a 15 minutos e, em seguida, transfira lentamente para a incubadora para incentivar a adesão.
As variações dessas técnicas incluem manipulação genética transitória antes da cultura e da imagem de lapso de tempo durante a incubação. Além disso, este protocolo permite a coleta de populações de células de crista neural prégratórias e migratórias para análise em nível de omics.
