从小鼠面部过程和培养的腭间充质细胞中分离全细胞蛋白质裂解物以进行磷酸化蛋白分析

该协议可用于更深入地了解哺乳动物颅面发育过程中活性磷酸化蛋白的动力学和作用。该方案克服了从两个生理相关背景（小鼠面部过程和培养的小鼠胚胎腭间充质细胞）分离蛋白质过程中脱磷酸化的常见障碍。必须快速移动，同时将所有试剂和材料保持在冰上，并在所有裂解缓冲液中使用磷酸酶抑制剂，以保持磷酸化蛋白质的完整性。

首先，将小鼠身体放在腹侧朝上，并将小鼠腹部喷洒70%乙醇的解剖板上。然后用直的Semken镊子捏住并抬起阴道口前方的皮肤，以打开腹腔。接下来，用直刀片手术剪刀在两侧以45度角切割抬起的皮肤，以产生V形，该形状延伸到四肢和后肢之间大约一半的每个侧表面。

使用Semken镊子，抓住其中一个子宫角，并用手术剪刀切开输卵管下方和子宫颈上方。为了完全切除子宫角，切除子宫中膜，然后将解剖的子宫角转移到10厘米培养皿中的10毫升组织学PBS中。同样，切除腹腔相对侧的第二个子宫角。

之后，将含有两个子宫角的10厘米培养皿放在冰上。在解剖体视显微镜下，用Dumont 5细镊子小心地从子宫角中解剖出每个胚胎。然后慢慢拉开子宫肌层、蜕膜和绒毛膜。

接下来，撕开并去除胚胎周围相对透明的羊膜，并切断连接胚胎和胎盘的脐带。然后使用切割的塑料转移移液管将每个解剖的胚胎转移到2.5毫升组织学PBS中，在冰上12孔细胞培养板的单个孔中。准备三个含有10毫升组织学PBS的10厘米培养皿，并将它们保存在冰上，以便在胚胎之间旋转。

然后使用切割的塑料移液管将一个胚胎从12孔细胞培养板的单个孔转移到具有组织学PBS的10厘米培养皿之一。在解剖显微镜下，使用细镊子将每个上颌突与面部分开，方法是首先沿着上颌突中分离外侧鼻突的自然压痕在上颌突的一个上颌突的前侧进行切割。接下来，沿着自然压痕切割上颌突的后侧，将上颌突和下颌突分开。

然后通过从上颌过程的眼睛侧上颌过程的前后侧垂直切割上颌过程来完全分离上颌过程，其中上面引用的自然压痕结束。使用带有两毫升小乳胶灯泡的9英寸巴斯德移液器，将解剖的上颌骨工艺在约30微升的组织学PBS小液滴中转移到冰上标记的35毫米培养皿中。然后使用巴斯德移液器将一对上颌过程组织转移到冰上标记的1.5毫升微量离心管中，从而最大限度地减少组织学PBS的转移。

此外，用巴斯德移液管在1.5毫升微量离心管中除去任何多余的组织学PBS。在冰上使用之前，立即加入0.1毫升冰冷的NP40裂解缓冲液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂。然后用200微升移液器上下移液10次。

接下来，涡旋10秒，然后用200微升的PIPETMAN上下移液10次，同时避免气泡的产生。在四摄氏度下孵育两小时，同时使用带有管式左轮手枪的1.5毫升或两毫升桨叶进行端到端旋转。然后将样品以13，500×g在4摄氏度下离心20分钟，并将上清液收集到具有200毫升PIPETMAN的冰上新的1.5毫升微量离心管中。

首先，使用连接到真空系统的5.75英寸巴斯德移液管从小鼠胚胎腭间充质细胞中抽吸培养基。然后用冰冷的组织培养PBS洗涤细胞两次，并在最后一次洗涤期间将板向侧面倾斜，以确保所有组织培养PBS被吸出。接下来，在冰上使用之前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷NP40裂解缓冲液以裂解细胞。

将板在冰上孵育五分钟，大约每分钟旋转一次，以确保板完全覆盖。然后使用预冷的细胞提升器将细胞从板上刮下，并将细胞悬浮液转移到冰上预冷的1.5毫升微量离心管中。之后，将细胞悬浮液在四摄氏度下孵育30分钟，同时使用1.5毫升或两毫升桨和管式左轮手枪进行端对端旋转。

然后将样品以13，500×g在4摄氏度下离心20分钟，并将上清液收集到具有200毫升PIPETMAN的冰上新的1.5毫升微量离心管中。在用PDFG-B配体刺激2至15分钟后，对永生化小鼠胚胎腭间充质细胞的全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，揭示了在相应总蛋白条带高度或附近运行的磷酸化蛋白的不同可重复条带。与未处理的细胞相比，用生长因子处理时观察到磷酸蛋白条带强度的增加，而样品之间的总蛋白条带强度相对相等。

该协议可用于探究扰动和磷酸化如何直接影响颅面环境中的细胞间信号传导，基因表达和细胞活性。