此协议非常重要，原因有二。第一，它允许用户能够确定从动物模型中分离的皮肤细胞的细胞周期状态。它还使我们能够分析细胞周期离散阶段的蛋白质表达。
与以往确定细胞增殖的方法相比，我们的方法允许更精确地测定细胞周期的不同阶段，还可以分析细胞分裂不同阶段的40多个不同标记。这大大提高了该方法的应用和多功能性。该协议可用于癌症研究和任何其他类型的疾病，其中需要确定细胞周期特定的蛋白质表达模式。
此外，该协议可以修改为其他细胞类型，并在其他模型生物体。第一次用户应该专注于尽可能获得最高质量的细胞准备。这要求使用新鲜试剂及时处理实验皮肤，最少的组织消化时间，并在离心后仔细处置上流液，以保持细胞的完整性和数量。
首先，使用免费的在线面板设计软件设计金属标记抗体面板，如手稿中所述。然后，在 60 摄氏度的正常氢氧化钠中，以每毫升 10 毫克的速度溶解 IdU 粉，然后准备 IdU 库存溶液。将IdU库存溶液等到微离心管后，在零下20摄氏度处冷冻，进行长期储存。
使用前，立即将IdU溶液的pH值调整为7.5，用12个普通盐酸，并在丢弃的分条上测试，以确保溶液的pH值为7.5。要准备 2 x 对甲醛固定溶液，请将 5 毫升 10 x PBS 和 1 毫升 16%PFA 与 44 毫升纯分子级蒸馏水混合。要准备 100 毫摩尔顺铂库存溶液，在 10 毫升 DMSO 中溶解 300.5 毫克顺铂粉。
对于在一天内使用的实验，准备一个10毫摩尔顺铂工作溶液。称重小鼠，然后确定每克体重0.1毫克IdU的剂量。通过内皮内注射管理IDU的计算剂量，并等待两个小时，然后收获细胞。
使用一双手术级剪刀手术切除以前在耳底注射了IdU的安乐死小鼠的耳朵。将耳朵放在干燥的100毫米培养皿上。小心地将前部与后皮分开，使用细钳在切割区域的中间或边缘创建一个口袋，然后将两个皮肤皮瓣分开，然后继续处理前皮和后皮。
小心地将一只耳朵的前部和后部皮肤放在 12 井培养板的一个井中，用一毫升新鲜准备好的脱皮/胶原酶溶液填充，皮肤的脱毛侧接触溶液。在37摄氏度下孵育一小时，消化皮肤。将消化的耳朵或新生儿皮肤放在干净的培养皿中，表皮侧接触盘子的表面。
使用钳子，将皮肤压平，然后以圆形图案从中心工作到边缘，轻轻地将真皮从表皮上滑下来。用钳子，抓住边缘的表皮，轻轻将其从培养皿表面剥下来。小心地将表皮放在预加热的细胞分离溶液上，放在一个良好的板中。
在37摄氏度下孵育5分钟，或在室温下孵育20分钟。使用无菌钳子抓住表皮，通过将表皮拖到盘子底部来分离细胞，进行擦洗。加入含有1%FBS的一毫升DMEM，通过40微米细胞筛入收集管。
用额外的两毫升DMEM冲洗好，并加入细胞悬浮液。在120次g下离心5分钟后，小心吸上经。将细胞颗粒重新在含有1%FBS的一到两毫升DMEM中，并像以前一样再次对细胞进行颗粒化。
要标记细胞以确定活细胞和死细胞，在含有25微摩尔顺铂和孵育一分钟的DMEM中重新发送100万到300万个细胞。通过以相等的 FBS 体积进行移液进行淬火。在120次g下离心5分钟后，将上经剂倒入含有稀释漂白剂的烧杯中，然后反转管子，将剩余的溶液排入纸巾。
将细胞颗粒重新浓缩在两毫升无阳离子PBS中，然后像前面所述再次离心。要修复细胞，将细胞颗粒重新在一毫升无阳离子PBS中。在连续低功耗下旋转细胞，并添加两个 x PFA 固定缓冲液的一毫升。
放在摇杆上，在室温下孵育10分钟。在500次g下离心5分钟后，小心地将上经剂去掉。用两毫升无阳离子PBS清洗细胞，在相同条件下再次离心，然后重复洗涤步骤。
最后，将颗粒重新在两毫升无阳离子PBS中重新释放。将细胞以500倍g离心5分钟，并小心地将上一液去下。将细胞重新在一毫升的一个x固定缓冲液中，在室温下孵育10分钟，然后重复离心。
要清洗细胞，请添加一毫升条形码渗透缓冲液。在500次g的细胞离心过程中，5分钟，通过添加100微升的条形码渗透缓冲器来准备条形码，并立即混合。将细胞颗粒重新填充在 800 微升的条形码渗透缓冲液中。
在室温下向细胞添加条形码溶液，混合并孵育30分钟。在500次g下离心5分钟。在两毫升的细胞染色缓冲液中清洗细胞，并再次离心。
接下来，在一毫升核抗原染色缓冲液中重新填充100万至300万个细胞，并在室温下孵育30分钟。在500次g下离心5分钟后，小心地将上经剂去掉。将细胞重新浓缩在一毫升核抗原染色渗透缓冲液中，并再次离心。
重复再增和离心后，用温和的涡流将细胞颗粒重新在残余体积中。加入50微升细胞内抗体鸡尾酒，在室温下混合并孵育45分钟。添加两毫升细胞染色缓冲液。
在与上一步相同的条件下再次离心，并取出上一代。将颗粒重新浓缩在两毫升细胞染色缓冲液中，以 500 倍 g 离心五分钟，然后重复重新增减和离心。将细胞重新在一毫升的间解中，在四摄氏度下储存一到三天。
再次离心细胞后，用两毫升细胞染色缓冲液清洗颗粒，在相同条件下离心，用两毫升水进行两次额外的洗涤，同时进行同样的离心。用稀释的EQ珠溶液以每毫升一百万个细胞的浓度重新暂停细胞颗粒，然后在质量细胞仪上运行样品。成人小鼠耳朵和新生儿皮肤的预期细胞产量和生存能力被确定。
近似产量取决于皮肤的表面面积。新生儿皮肤是需要更多细胞的实验的更好选择。在条形码质量细胞学数据规范化和去卷积后，为完整、单细胞和可行细胞选择基本浇注策略。
活细胞的百分比可能表明染色前细胞的质量或状况。培养的癌细胞与分离的小鼠耳细胞之间的生存能力也显示出差异。活细胞在事件长度与CD45上被封闭，以排除造血细胞。
包含血统标记允许在不同细胞周期阶段选择感兴趣的细胞群。在荧光流式细胞仪中，通过检测BrdU与PI获得基本细胞周期特征。然而，包含具有质量细胞学的其他增殖标记，可以更精确地识别细胞周期相。
按照这种方法，可以为不同的细胞类型或实验条件构建细胞周期配置文件，例如同一实验中 CD45 阴性细胞与 CD45 阳性细胞的轮廓。在另一个示例中，对定义 G-One 相中 EGFR 和 mTOR PI3K 信号通路标记的分析揭示了 CD45 负细胞中类似的表达配置文件，以橙色和 CD45 正细胞显示，以蓝色显示。质量细胞学需要大量的高质量细胞。
如果用户对稀有细胞组感兴趣，可能需要更多的细胞。分离的活细胞可用于DNA或RNA分析、生化研究，或可用于组织培养之前固定和染色的大规模细胞学。使用甲醛、盐酸或氢氧化钠时，用户应使用个人防护设备和安全柜（如有必要）。
