从人多能干细胞中产生气道上皮细胞气液界面培养物

该方案是有帮助的，因为它提供了易于遵循的步骤，允许产生功能性气道上皮细胞，然后可用于研究气道生物学的各个方面。该方案的主要优点是能够产生许多功能性气道上皮细胞培养物，同时避免获得和培养原代气道细胞的困难。演示该程序的将是来自我们实验室的研究生Taylor Matte。

首先在冰上解冻足够体积的3D矩阵。将其保存在冰上，直到准备使用。通过将一小瓶先前冷冻保存的iBC单细胞悬浮液在37摄氏度的水或珠浴中孵育，直到没有可见的冷冻培养基，将其解冻。

使用五毫升血清移液器，将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中。向细胞悬浮液中滴加6至10毫升DMEM / F12。轻轻混合并以300 RCF离心五分钟以沉淀细胞。

吸出上清液并用P1000微量移液管将细胞沉淀重悬于一毫升基底细胞培养基中。准备10微升等分试样并进行细胞计数。将细胞以300 RCF离心五分钟。

吸出上清液，并以每微升4， 000个细胞的密度重悬于先前用P1000微量移液管在3D基质中解冻的细胞。使用P200微量移液管，将对应于约25至50微升的基质溶液液滴加入到12孔组织培养处理的板的每个孔的基底。将板在37摄氏度孵育约15分钟。

然后向每个孔中加入足够的基础细胞培养基，以使用五毫升血清学移液管将液滴完全浸没。将板放回加湿的培养箱中。每两天使用新鲜的基底细胞培养基喂养细胞。

用五毫升血清移液管将新鲜培养基加入孔的侧面，注意不要干扰细胞液滴。在冰上解冻足够体积的3D矩阵。将其保存在冰上，直到准备使用。

在孵育培养板约五至七天后，从每个孔中吸取培养基，然后使用P1000微量移液管，直接在球体上加入一毫升的分散酶II以从基质液滴中解离。将板放入37摄氏度的培养箱中10至15分钟。使用P1000微量移液管，通过上下移液两次来混合分散酶，分解3D基质的大团块。

将板恢复到37摄氏度再持续30至40分钟，使基质完全溶解。当3D基质的液滴在光学显微镜下不再可见时，使用5毫升血清移液器吸头将自由漂浮的球体加入15毫升锥形管中。加入DMEM/F12，使最终体积为每锥形管10毫升，并在200 RCF下离心三分钟以沉淀球体。

抽出上清液，并为每一滴解离的初始液滴加入一毫升0.05%胰蛋白酶。在37摄氏度下孵育，每两到三分钟研磨一次。每隔几分钟用光学显微镜评估一次溶液。

当超过90%的球状体解离到单细胞时，在胰蛋白酶中加入10%的胎牛血清。通过40微米的细胞过滤器过滤细胞，并在300 RCF下离心五分钟。进行细胞计数，并以每微升解冻的3D基质400个细胞的密度均匀地重悬细胞。

避免引入气泡。根据需要重悬尽可能多的液滴以进行下游应用。对每个孔重复此过程。

在最近一次传代10至14天后，如前所述，将球状体解离为单细胞悬浮液并进行细胞计数。将单元格重悬于排序缓冲区中。这将是主要人口。

将25至50微升的小等分试样转移到单独的管中。这将是次要人口。将偶联抗NGFR抗体添加到主细胞群中。

向小细胞群添加同种型对照抗体。保护细胞免受光照，并将它们保持在冰上30分钟，间歇性地对细胞进行研磨以防止沉淀。30分钟后，将分类缓冲液加入每管细胞。

将细胞以300 RCF离心五分钟。吸出上清液，在分选缓冲液中重悬沉淀的细胞，并加入活细胞或死细胞染色剂。使用适当的NGFR阳性门控策略，对足够的NGFR阳性细胞进行分类，用于必要的下游应用。

根据制造商的说明，通过在顶端室中加入200微升的基质来制备6.5毫米多孔膜插入物。将其置于37摄氏度至少两小时，然后需要。从刀片的顶端腔室吸出涂层基质。

向基底外侧腔室中加入500微升基底细胞培养基。在100至200微升基底细胞培养基中重悬至少30， 000个分类的NGFR阳性细胞，并使用P200微量移液管转移到顶端室。对剩余的孔重复上述步骤。

将板置于加湿的37摄氏度培养箱中。在两到三天内，吸入顶端和基底外侧腔室，并用新鲜的基底细胞培养基喂养。每天用光学显微镜监测顶端室。

当细胞汇合度达到80%以上时，在顶端和基底外侧室中用ALI分化培养基替换基底细胞培养基。通过保持介质容器用铝箔包裹并在可能的情况下关闭头顶灯来保护ALI差异化介质免受光照。第二天，从顶端室吸出培养基，从而将顶端表面暴露在空气中。

每两至三天更换基底外侧腔内的ALI分化培养基。每1至2天监测一次培养物外观。小心地从顶端腔室中吸取任何积聚的液体，而不会干扰细胞层。

轻轻地向顶腔内加入100微升不含钙或镁的PBS，以去除碎屑或粘液。在37摄氏度下孵育10分钟，然后小心地吸出PBS。评估 TEER 的上皮完整性。

空气暴露7至10天后，使用光学显微镜观察多纤毛的外观。根据计划的实验和读数，可以在暴露14至28天后分析细胞。在最近一次3D培养传代10至14天后，如前所述，将球状体解离为单细胞悬浮液。

进行细胞计数，将细胞悬液重悬于冷冻保存培养基中的冷冻保存中。将冷冻管放入容器中，以确保温度稳定下降。并转移到零下80摄氏度24至48小时，然后转移到零下150摄氏度长期储存。

使用这种门控技术，28%的活单细胞是NGFR阳性。两天后，单个细胞最初很容易识别，并具有细长的纺锤形外观。再过两天，细胞形成融合且松散堆积的单层。

在随后的几天到几周内，细胞形成了一个紧密堆积，高度细胞的上皮层。7到10天后，明显出现了跳动纤毛和粘液的产生。测量样品的TEER，结果与原代气道上皮细胞对照样品的测量结果相似。

随后用多聚态醛固定，并对MUC5AC和乙酰化α-微管蛋白等进行规范气道上皮细胞标志物的免疫标记。按照该协议，研究人员可以生成大量患者来源的气道上皮细胞培养物，以评估各种读数，包括测试基底细胞，分泌细胞和多纤毛细胞在疾病和健康中的功能的读数。