RNA FISH 染色可用于自然定植或感染秀丽隐杆线虫的微生物（包括微生物组细菌和细胞内病原体）的可视化、鉴定和定量。这种技术简单、快速且强大，允许人们在整个完整动物的背景下有效地染色和可视化微生物。我们可以使用RNA FISH来检测和可视化野生秀丽隐杆线虫中的肠道微生物组细菌。
这可以帮助我们了解哺乳动物系统中的类似相互作用。将具有所需感兴趣微生物的线虫从NGM板转移到微量离心管后，通过将一毫升1X PBST添加到微量离心管中来洗涤线虫。在微量离心机或纳米离心机中以适当的速度旋转样品。
使用移液器除去除 100 微升外的所有上清液。用PBST重复洗涤两到三次。要用多聚甲醛固定线虫，首先将33微升16%多聚甲醛加入线虫颗粒上方含有100微升上清液的微量离心管中，最终浓度为4%多聚甲醛。
将含有定植或感染目标微生物的线虫的样品在室温下孵育30至45分钟。除去多聚甲醛溶液，向样品中加入0.5毫升PBST。如文本手稿中所述，在微量离心机中以适当的速度旋转样品。
用移液管在不干扰沉淀的情况下尽可能多地去除上清液。向微量离心管中的样品中加入0.5毫升PBST。用PBST重复洗涤两到三次。
最后一次洗涤后，旋转样品并除去上清液，使沉淀不受干扰。接下来，每个样品准备一毫升杂交缓冲液。将800微升杂交缓冲液加入含有线虫沉淀的微量离心管中。
在微量离心机中沉淀样品。在不干扰沉淀的情况下除去上清液。用所需的FISH探针制备每个杂交缓冲液样品100微升，最终浓度为每微升探针5至10纳克，并涡旋混合。
向每个样品中加入100微升含有FISH探针的杂交缓冲液。通过轻轻轻弹或倒置试管进行混合。将样品在 46 至 54 摄氏度的干浴中孵育过夜，或在 46 至 54 摄氏度的热混合器中以每分钟 1， 200 转的速度孵育过夜。
每个样品准备三毫升洗涤缓冲液。以适当的速度离心样品。使用移液管取出杂交缓冲液，同时小心保持线虫沉淀不受干扰。
向每个样品中加入一毫升准备好的洗涤缓冲液。以适当的速度离心样品。使用移液管取出洗涤缓冲液，同时小心使沉淀不受干扰。
向每个样品中加入一毫升准备好的洗涤缓冲液。将样品在48至56摄氏度的干浴或热混合器中以每分钟1， 200转的速度在48至56摄氏度的干浴中孵育一小时。如果在干浴中孵育，请每 15 到 20 分钟轻轻倒置试管。
以适当的速度离心样品。使用移液器取出洗涤缓冲液，同时小心使沉淀不受干扰。向每个样品中添加 100 至 500 微升 PBST。
此时，样品可以在 4 摄氏度的 PBST 中储存长达一周，直到协议准备好继续。以适当的速度沉淀样品。在不干扰线虫颗粒的情况下尽可能多地去除PBST。
向样品中加入 20 微升含有 DAPI 的抗褪色封片剂。用200微升移液器吸头装入20微升移液器，然后用剪刀剪掉移液器的尖端，以便移液较大的线虫。使用切开的移液器尖端，将5至10微升的沉淀转移到显微镜载玻片上。
用 22 x 22 的盖玻片盖住。要存放载玻片，请用指甲油密封盖玻片的边缘，并将它们保存在四摄氏度的暗盒中，直到准备进一步使用。在微分干涉对比显微镜下，发现一种野生热带盲肠炎菌株被一种细菌定植，该细菌似乎定向地粘附在肠上皮上。
来自绿色通用16S rRNA探针和红色α变形杆菌物种探针的荧光信号完全重叠，表明大多数在肠道定植的细菌是粘附的α变形杆菌细菌。奥赛病毒的二分RNA基因组由RNA1和RNA2片段组成，并且已经开发出针对这两个片段的FISH探针。用绿色荧光蛋白标记的 ZIP1 蛋白位于细胞核中，这些细胞核在细胞质中显示奥赛病毒 FISH 染色阳性。
显示用Orsay特异性或N.parisii特异性FISH染色的多只动物以指示该信号的强度，以便于定量。秀丽隐杆线虫与两个微孢子虫寄生虫的混合感染 使用竞争与 18S 结合的物种特异性探针，使用 DAPI 染色细胞核可以在整个动物的背景下更好地定位感染，特别是对于具有大、易于识别的细胞核的肠道。巴黎猪笼草感染导致梅龙特发育成孢子。
所得的FISH染色显示出小而大的杆状结构，这些结构可能与巴黎猪笼草孢子相对应，这些孢子用红色的猪笼草特异性探针染色。选择固定剂时，请记住PFA固定可以更好地保存形态和转基因GFP，但丙酮固定对于孢子质的可视化是必要的。RNA FISH可用于识别和可视化在秀丽隐杆线虫肠道中定植的细菌。
然后，研究人员可以进行更多的遗传筛选，以确定参与这些宿主 - 微生物相互作用的因素。
